Summary

De Swimmeret Systeem van rivierkreeftjes: Een praktische gids voor de dissectie van de Nerve Koord en extracellulaire Opnamen van de Motor van het Patroon

Published: November 25, 2014
doi:

Summary

Here we describe the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. We also demonstrate an electrophysiological technique to record fictive locomotion from swimmeret motor neurons.

Abstract

Hier laten we zien de ontleding van de rivierkreeft buik zenuwkoord. Het preparaat de laatste twee thoracale ganglia (T4, T5) en de keten van abdominale ganglia (A1 tot A6). Deze keten ganglia omvat het deel van het centrale zenuwstelsel (CZS) dat gecoördineerde voortbeweging van de pleopods (swimmerets) aandrijft: het swimmeret systeem. Het staat bekend om meer dan vijf decennia dat in rivierkreeft elke swimmeret wordt aangedreven door zijn eigen onafhankelijke patroon genereren kernel die ritmische afwisselende activiteit 1-3 genereert. De motorische neuronen innerveren de spieren van elk swimmeret bestaan ​​uit twee anatomisch en functioneel verschillende bevolkingsgroepen 4. Men is verantwoordelijk voor het terugtrekken (arbeidsslag, PS) van de swimmeret. De andere drijft de protractie (terugslag, RS) van de swimmeret. Motorneuronen van het swimmeret systeem kunnen spontaan een fictief motor patroon, dat identiek is aan het patroon gevonden in vivo </em> 1.

Het doel van dit rapport is om een ​​interessante en handige model systeem in te voeren voor het bestuderen van ritme genereren netwerken en coördinatie van onafhankelijke microschakelingen praktische practica studenten '. Het protocol voorwaarde bevat stap-voor-stap instructies voor de dissectie van abdominale zenuwkoord de rivierkreeft's, pinning van de geïsoleerde keten van ganglia, desheathing de ganglia en het opnemen van de swimmerets fictieve motor patroon extracellulair uit de geïsoleerde zenuwstelsel.

Bovendien kunnen we de activiteit van neuronen swimmeret intracellulair opgenomen van dendrieten volgen. Hier hebben we ook een korte beschrijving van deze technieken en bieden een aantal voorbeelden. Verder kan de morfologie van neuronen swimmeret beoordeeld worden met verschillende kleuringen. Hier geven we voorbeelden van intracellulaire (door iontoforese) kleurstof gevuld neuronen en backfills zwembaden van swimmeret motorische neuronen. In ons labwe deze preparaat basisfuncties fictieve beweging, het effect van sensorische feedback op de activiteit van het CZS en coördinatie tussen microschakelingen bestuderen op cellulair niveau.

Introduction

De swimmerets van rivierkreeft serveren een functie in de houding controle en sloeg ritmisch wanneer de dieren zwemmen naar voren, ventileren hun holen of vrouwtjes beluchten hun eieren 5, 6. De swimmerets van de rivierkreeft, Pacifastacus leniusculus, komen in paren van de tweede naar de vijfde abdominale segment, één ledemaat aan elke kant van het abdomen 7. Het centrale zenuwstelsel produceert op zichzelf de ritmische motor babbel die swimmeret beweging in het intacte dier en in de geïsoleerde zenuwkoord bereiding aandrijft. Als er geen zintuiglijke feedback of aflopende ingang aanwezige ritmisch motor patroon geproduceerd wordt fictief voortbeweging 1, 2. In het swimmeret systeem is deze motor patroon in niets parameter van de activiteit van de swimmerets gemeten in het intacte dier.

De beweging van elke swimmeret wordt aangedreven door een microcircuit dat zich in en beperkt tot een corresponding hemiganglion 1 -. 3 In elke microschakelings- er een patroon te genereren kernel die vijf geïdentificeerde niet stekelige interneuronen bestaat. Ze kunnen functioneel worden gekarakteriseerd als zijnde ofwel Inhibitor van Power Stroke (IPS) of Inhibitor van Return Stroke (IRS) 8. Deze IPS en IRS interneuronen zijn niet endogeen oscillatoren, in plaats van hun afwisselende activiteit wordt gedreven door wederzijdse inhibitie 9. Omdat deze interneuronen remmen de swimmeret motorische neuronen rechtstreeks, wordt de afwisselende PS-RS beweging gegenereerd 10. Locomotion echter niet alleen vereist het genereren van de activiteit, maar ook de coördinatie van de verschillende onafhankelijke microschakelingen. In het swimmeret systeem zoals coördinatie door de coördinerende microschakeling die ervoor zorgt dat ledematen actief zijn correct momenten. Dit microcircuit is gebouwd door drie geïdentificeerde neuronen in elk segment 11-15.

Dit protocol voorziet in the eerst stap voor stap dissectie gids voor de keten ganglia (T4 A6, figuur 1) te isoleren. We laten zien hoe u de geïsoleerde abdominale zenuwkoord pin en desheathe elk ganglion. In deze geïsoleerde preparaat zenuwstelsel, de neuronen belast swimmeret beweging zijn gebruiksklaar in elektrofysiologische en morfologische experimenten. Het tweede deel van dit protocol toont de belangrijkste kenmerken van de swimmeret motor patroon. Dit omvat een stap-voor-stap handleiding voor het extracellulair staat de activiteit van swimmeret motorische neuronen. Axonen van RS motorische neuronen projecteren via de voorste tak van zenuw N1, terwijl axonen van PS motorische neuronen projecteren via de achterste tak van dezelfde zenuw (figuur 1) 4. Derhalve hun activiteit kan worden opgenomen van deze takken met differentiële pinelektrodes.

Figuur 1<br/> Figuur 1: Geïsoleerde zenuwstelsel van thoracale ganglion 4 (T4) van de buik ganglion 6 (A6) en een schematisch diagram van het T4. Thoracale ganglion 4; T5: thoracale ganglion 5; A1, A2 … A6 buik ganglion 1, abdominale ganglion 2 … buik ganglion 6; N1: zenuw N1; N2: zenuw N2; N3: zenuw N3; PS: power-slag; RS: return-takt. Directionele afkortingen: A = anterior; P = posterior.

Deze dissectie procedure en de elektrofysiologische techniek gedemonstreerd zijn handig voor studenten en kunnen studenten praktische cursussen aanvullen in de fysiologie. De geïsoleerde keten ganglia is gebruikt in een aantal experimenten zenuwstelsel functie coördinatie of modulatie van swimmeret microcircuits 6 en neuronale controle van adaptief gedrag in beweging 16, 17 bestuderen. De rivierkreeft swimmeret biedt dus een enorme hoeveelheid interessante onderwijs of tregende het kansen die allemaal beginnen met de dissectie van de ventrale zenuw koord van rivierkreeft en extracellulaire van de fictieve motor patroon.

Protocol

Deze dissectie procedure is in overeenstemming met de Europese Gemeenschappen Richtlijn van de Raad van 22 september 2010 (2010/63 / EU). 1. Voorbereiding Verkrijgen rivierkreeft, Pacifastacus leniusculus (Dana), van beide geslachten ≥8 cm groot. Zorg ervoor dat de dieren zijn van vitaal belang en de buik en de buik ledematen intact zijn. Zorg ervoor dat het schild te inspecteren en dat dit cuticula is hard en stijf. Pre- en postmolt dieren een zach…

Representative Results

Met de gelijktijdige extracellulaire opnames goede kant en PS motorneuronen van een ganglion, de afwisselende werking van deze motor neuron pools kunnen worden gevolgd (Figuur 18), die het fictieve motoriek patroon. Figuur 18: Schematische voorstelling van een ganglion en plaatsing van differentiële pin elektrode extracellulaire opname van RS motorische neuronen (bovenste trace…

Discussion

De anatomie van rivierkreeft en hun buik ganglia is eerder beschreven 5, 18, ​​19, 20 en het wordt aanbevolen om vertrouwd te raken met hen voorafgaand geworden om de dissectie om het snijden van belangrijke zenuwen te voorkomen.

Het is cruciaal om het preparaat bij temperaturen onder 23 ° C houden om afbraak van het geïsoleerde zenuwkoord voorkomen. Dit kan gemakkelijk worden bereikt door vervanging van de badoplossing elke 20-30 min met koude rivierkreeft zoutoplossi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij bedanken Jos Burgert voor het helpen met een aantal van de cijfers. We zijn dankbaar voor Ingo Selbach (en de groep "Edelkrebsprojekt NRW") voor zijn inspanningen om het lab te voorzien van proefdieren. Wij danken Anna C. Schneider voor proeflezen eerste versies van het manuscript. Dit onderzoek werd gesteund door een Emmy Noether DFG subsidie ​​SM 206 / 3-1 en een startup subsidie ​​van de Universiteit van Keulen voor vrouwelijke docenten.

Materials

Name of Material/ Equipment Type Company Catalog Number Comments/   Description
4-channel extracellular amplifier: MA 102  Amplifier Elektroniklabor, Zoologie, Universität zu Köln, Germany for extracellular recording
air-table Technical Manufacturing Corporation
(TMC) a unit of AMETEK Ultra Precision Technologies, Peabody, MA, USA
63-534 for intracellular recording
Axon Digidata 1440A Digitizer Axon Instruments, Molecular Devices Design, Union City, CA DD1440A digitizes recorded signals 
big bucket  filled with ice
Clampex & Clampfit pClamp 10, recording and analysis software Molecular Devices Design, Union City, CA pClamps 10 Standard for extracellular recording
cold lamp source with flexible light guide (fiber optic bundle)  Euromex microscopes holland, Arnhem, BD LE.5211 & LE.5235
computer and monitor equipped with recording software for extracellular recording
container and pipette for liquid waste 
crayfish saline  contains (in mM): 5.4 KCl, 2.6 MgCl2, 13.5 CaCl2, and 195 NaCl, buffered with 10mM Tris base and 4.7mM maleic acid; aerated for 3 hours. Adjust at pH of 7.4.  always keep at temperatures ~ 4° C
dextran, Texas Red (3000MW, lysine fixable) fluorescent dye, lysine fixable Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany D3328 for intracellular dyefill of neurons
differential pin electrodes made from stainless steel ɸ 0.2 mm for extracellular recording
dissection dish  (l x w x h) 15x7x5 cm; linned with black silicone used in the gross disection
faraday cage for extracellular recording
fixing pins for pinning the specimen
forceps (biology, Dumont #5) Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX Fine Science Tools (FST), Germany 11252-20 fine forceps: used to pick nerves
forceps (biology, Dumont #55) Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX Fine Science Tools (FST), Germany 11255-20 extra fine forceps: used for desheathing
forceps (electronic, Dumont #5) Forceps: Standard, tip 0.1 x 0.06 mm, length 11cm, INOX Fine Science Tools (FST), Germany 11251-20 coarse forceps:                          used to grab specimen and pins
intracellular electrode Borosilicate glass capillaries (outer/inner diameter: 1mm/0.5mm), with filament Sutter Instruments, Novato, CA BF100-50-10 for intracellular recording and dyefill of neurons
Leica S8 Apo StereoZoom Dissection Microscope                       Zoom 1x – 8x Leica, Germany 10446298 for extracellular recording
microscope table for extracellular recording
mirror to illuminate preparation from below for extracellular recording
modeling clay for extracellular recording
Olympus SZ61 Dissection Microscope                       Zoom 0.67x – 4.5x Olympus, Germany for the dissection
petri dish  94 x 16 mm; lined with clear silicone Greiner bio-one, Germany 633180 used to pin the isolated chain of ganglia
ring scissors ThoughCut, cutting edge: sharp/blunt, straight: 13cm Fine Science Tools (FST), Germany 14054-13 for gross dissection                    (steps 2.1 – 2.11)
saline dispenser  with a 16 gauge needle (outer ɸ 1.6mm) attached via a flexible tube. Volume ~ 60ml, used for exsanguination
spring scissors or alternative: Vannas spring scissors cutting edge: 8 mm, tip diameter: 0.2mm, straight: 10cm or cutting edge 2.5 mm, tip diameter 0.075 mm, straight: 8cm Fine Science Tools (FST), Germany 15024-10 or          15000-08 for desheathing 
stainless steel wire ɸ 0.125 mm  to cut pins of 4-7 mm length Goodfellow GmbH, Bad Nauheim, Germany for pinning of the nerve cord
student Vannas  spring scissors or alternative:  Moria Spring Scissors cutting edge: 5mm, tip diameter: 0.35mm, straight: 9cm or cutting edge: 5mm, tip diameter 0,1 mm, straight: 8 cm Fine Science Tools (FST), Germany 91500-09 or           15396-00 for gross and fine disection        (steps 2.11 – 3.14)
sylgard 184 Silicone Elastomer Base and Curing Agent; for black sylgard add activated carbon Dow Corning, Midland, MI, USA
syringe filled with petroleum jelly and equipped with a 20 gauche needle with rounded tip for extracellular recording

References

  1. Hughes, G. M., Wiersma, C. A. G. The Co-Ordination of Swimmeret Movements in the Crayfish, Procambarus-Clarkii (Girard). J Exp Biol. 37 (4), 657-670 (1960).
  2. Mulloney, B., Smarandache, C. Fifty Years of CPGs: Two Neuroethological Papers that Shaped the Course of Neuroscience. Front Behav Neurosci. 4, 45 (2010).
  3. Murchison, D., Chrachri, A., Mulloney, B. A Separate Local Pattern-Generating Circuit Controls the Movements of Each Swimmeret in Crayfish. J Neurophys. 70 (6), 2620-2631 (1993).
  4. Mulloney, B., Hall, W. M. Functional organization of crayfish abdominal ganglia. III. Swimmeret motor neurons. J Comp Neurol. 419 (2), 233-243 (2000).
  5. Davis, W. J. Lobster Righting Responses and Their Neural Control. Proc R Soc Ser B-Bio. 170 (1021), 435-456 (1968).
  6. Mulloney, B., Smarandache-Wellmann, C. Neurobiology of the crustacean swimmeret system. Prog Neurobiol. 96 (2), 242-267 (2012).
  7. Huxley, T. H. . The crayfish: An introduction to the study of zoology. , (1980).
  8. Smarandache-Wellmann, C., Weller, C., Wright, T. M., Mulloney, B. Five types of nonspiking interneurons in local pattern-generating circuits of the crayfish swimmeret system. J Neurophys. 110 (2), 344-357 (2013).
  9. Skinner, F. K., Mulloney, B. Intersegmental coordination of limb movements during locomotion: mathematical models predict circuits that drive swimmeret beating. J Neurosci. 18 (10), 3831-3842 (1998).
  10. Mulloney, B. During fictive locomotion, graded synaptic currents drive bursts of impulses in swimmeret motor neurons. J Neurosci. 23 (13), 5953-5962 (2003).
  11. Smarandache-Wellmann, C., Grätsch, S. Mechanisms of coordination in distributed neural circuits: Encoding coordinating information. J Neurosci. 34 (16), 5627-5639 (2014).
  12. Mulloney, B., Hall, W. M. Local commissural interneurons integrate information from intersegmental coordinating interneurons. J Comp Neurol. 466 (3), 366-376 (2003).
  13. Mulloney, B., Harness, P. I., Hall, W. M. Bursts of information: Coordinating interneurons encode multiple parameters of a periodic motor pattern. J Neurophys. 95 (2), 850-861 (2006).
  14. Smarandache, C., Hall, W. M., Mulloney, B. Coordination of Rhythmic Motor Activity by Gradients of Synaptic Strength in a Neural Circuit That Couples Modular Neural Oscillators. J Neurosci. 29 (29), 9351-9360 (2009).
  15. Smarandache-Wellmann, C., Weller, C., Mulloney, B. Mechanisms of Coordination in Distributed Neural Circuits: Decoding and Integration of Coordinating Information. J Neurosci. 34 (3), 793-803 (2014).
  16. Chrachri, A., Neil, D., Mulloney, B. State-Dependent Responses of 2 Motor Systems in the Crayfish, Pacifastacus leniusculus. J Comp Physiol A. 175 (3), 371-380 (1994).
  17. Chrachri, A., Neil, D. M. Interaction and Synchronization between 2 Abdominal Motor Systems in Crayfish. J Neurophys. 69 (5), 1373-1383 (1993).
  18. Skinner, K. The Structure of the 4th Abdominal-Ganglion of the Crayfish, Procambarus-Clarki (Girard) II. Synaptic Neuropils. J Comp Neurol. 234 (2), 182-191 (1985).
  19. Skinner, K. The Structure of the 4th Abdominal-Ganglion of the Crayfish, Procambarus-Clarki (Girard) I. Tracts in the Ganglionic Core. J Comp Neurol. 234 (2), 168-181 (1985).
  20. Mulloney, B., Tschuluun, N., Hall, W. M. Architectonics of crayfish ganglia. Microsc Res Techniq. 60 (3), 253-265 (2003).
  21. Braun, G., Mulloney, B. Cholinergic modulation of the swimmeret motor system in crayfish. J Neurophys. 70 (6), 2391-2398 (1993).
  22. Davis, W. J. Motoneuron Morphology and Synaptic Contacts – Determination by Intracellular Dye Injection. Science. 168 (3937), 1358-1360 (1970).
  23. Altman, J. S., Tyrer, N. M., Strausfeld, N. J., Miller, T. A. Filling Selected Neurons with Cobalt through Cut Axons. Neuroanatomical Techniques. , 373-402 (1980).
check_url/cn/52109?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Seichter, H. A., Blumenthal, F., Smarandache-Wellmann, C. R. The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern. J. Vis. Exp. (93), e52109, doi:10.3791/52109 (2014).

View Video