Долгосрочный длительной Визуализация мыши Cochlear эксплантов

Улитка млекопитающих является весьма приказал сложный орган. В мыши, между появлением примитивного внутреннего уха из слухового пузырька на день E11 и завершения программы развития на ранних этапах постнатального развития, множественные волны клеточной сигнализации и скоординированные изменения в экспрессии генов происходят. Запуск от основания к вершине из канала улитки звук обнаружения сенсорного эпителия, или орган Корти. Развитие органа Корти изысканно управляется таким образом, что к концу развития, он будет состоять из одного ряда внутренних волосковых клеток, три ряда наружных волосковых клеток перемежаются с пятью рядами поддерживающих клеток (два ряда столбов клеток, три Ряды клеток Дейтерса) ^1. Отклонение от этой точных результатов порядка в потере слуха, heighlighting важность studye OFTHE генезиса и паттерна сенсорного epithemlium ^2.

В пробирке культивирования эмбриональных Кок мышиЛеа является важным инструментом в изучении механизмов развития органа Корти. Эта техника была создана в 1974 году и в течение последних 40 лет, был использован для выяснения многих механизмов, посредством которых сенсорная эпителий указанных и орган Корти, установленных ^3. Улитка представляет собой сложный орган с динамическими процессами развития; манипуляция может занять до семи дней, чтобы проявить ^1. Например, при добавлении ингибиторов GSK 3β, чтобы кохлеарного культуры эксплантов на E13, оптимальный период инкубации наблюдать надежный эффект соединения составляет шесть дней ^4.

Живая визуализация развивающихся улитки позволяет расследование изменений в морфологии органа Корти, изменения в экспрессии генов, отслеживание мигрирующих, пролиферирующие или умирающие клетки, и это позволяет в режиме реального времени наблюдать за результатами фармацевтических средств и нарушение сигнализации Пути. До сих пор не живут изображений улиткив основном были выполнены с помощью конфокальной микроскопии для изображения небольших участков органа Корти на короткие периоды времени ^5-8, но эта техника имеет ограничения, связанные с эксплантата жизнеспособности. В визуализации эффектов долгосрочных манипуляций на медленных процессов развития, охраны окружающей среды визуализации имеет решающее значение. Обычно конфокальной системы живой визуализации использует увлажненный пластиковую коробку, которая сидит на микроскоп. Жара и влажность могут уйти через зазоры в инкубации поле, где она встречается со стола микроскоп, через окна доступа, через шарнирных отверстий и через зазоры вокруг различных частей microscope- такие как цель или источника света. Это не является оптимальным для поддержания здоровых эксплантов в течение более двух-трех дней.

Мы определяем «инкубатор микроскоп" в виде перевернутой буквы микроскопом запечатанном внутри стандартного CO ₂ инкубаторе, а не инкубатор построен вокруг микроскопа. Инкубатор микроскоп эксимеет тенденцию жизнь эксперимента таким образом, что вместо того, визуализации в течение двух или трех дней, образцы могут быть отображены на срок до двух недель. Инкубатор микроскоп дает прекрасную среду для роста и дифференцировки клеток, с минимальным нарушением чтобы эксплант культур и стандартные контролируемых условиях. В исследованиях, которые проводятся в течение нескольких дней он является общим прибегать к образцам изображений на ежедневной основе, удаляя их из инкубатора и проведение их в перевернутом флуоресцентным микроскопом. Хотя такой подход может работать, как вынуть посуду из инкубатора наносит нагрузку на чувствительной развивающейся ткани. Изменения в кислотности среда для культивирования и колебаний температуры за счет удаления из инкубатора может привести к нерациональному развития и нездоровой ткани. Визуализация и ту же область, в то же фокальной плоскости, и в той же ориентации на каждый момент времени является чрезвычайно сложной задачей. С помощью автоматизированной системы в термостате, можно поддерживать здоровымткани, для сбора изображений в несколько моментов времени, и чтобы гарантировать, что тот же площадь захватывается в каждом кадре. В последние годы были разработаны несколько интегрированных инкубаторов микроскоп ткани, они были полезны не только в клинической практике ^9, но и в стволовых клеток и рака исследований ^10,11.

Здесь мы приводим протокол для долгосрочного живого изображения эмбриональных мыши кохлеарных эксплантов. Мы используем автоматизированную систему микроскопии внутри стандартного CO ₂ инкубаторе, который имеет возможность захвата изображения нескольких образцов в точках заданного времени. Система состоит из инвертированного микроскопа, установленного внутри инкубатора. Образцы помещают во вращающийся возвышении, что дает возможность получить изображение из нескольких выборок в каждой временной точке. Освещение, захват изображения, и вращение помоста контролируются автоматизированной системы, работающей с помощью программного обеспечения Metamorph. Установив подпрограмму обработки изображений с помощью программного обеспечения мы можем установить эксперимент запустить до TWуплотнительные недели с минимальным вмешательством человека. В этом примере мы используем как яркий поле и флуоресценции, чтобы показать рост крупномасштабной и перегруппировку улитки, и, в частности, в prosensory регион. В этом эксперименте, cochleae будет расчленена из репортеров мышей Sox2 ^EGFP на эмбриональное день E13. Культур в пробирке будет создан, а затем изображается в течение пяти дней.