Enterovirus Kültür ve RT-qPCR Su Norovirüs Oluşum EPA Metot 1615 Ölçüm. Virüs Örneklerinin I. Koleksiyonu
Summary
EPA Method 1615 uses an electropositive filter to concentrate enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. This manuscript describes the procedure for collecting samples for Method 1615 analyses.
Abstract
EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. The standardized sampling component of the method concentrates viruses that may be present in water by passage of a minimum specified volume of water through an electropositive cartridge filter. The minimum specified volumes for surface and finished/ground water are 300 L and 1,500 L, respectively. A major method limitation is the tendency for the filters to clog before meeting the sample volume requirement. Studies using two different, but equivalent, cartridge filter options showed that filter clogging was a problem with 10% of the samples with one of the filter types compared to 6% with the other filter type. Clogging tends to increase with turbidity, but cannot be predicted based on turbidity measurements only. From a cost standpoint one of the filter options is preferable over the other, but the water quality and experience with the water system to be sampled should be taken into consideration in making filter selections.
Introduction
İnsan enterik virüsler gastrointestinal içinde çoğaltmak ve fekal-oral yoldan yayılır. Bu virüsler genellikle yüksek konsantrasyonlarda 1-3 kanalizasyon bulunurlar. Onlar kanalizasyon atıkları 4,5 inat, ve yüzey 6,7, zemin 8-10 ve 11 içme sularında tedavi edilebilir. Mevcut olduğunda, ABD'deki çevre sularından virüsün konsantrasyonu tipik olarak doğrudan ölçüm 12,13 için çok düşüktür. Bu, virüs büyük hacimlerde su gelen konsantre edildi gerektirir. Bilgi Toplama Kuralı (ICR), ABD Çevre Koruma Ajansı (USEPA) 14 tarafından yürütülen izleme sırasında, bulaşıcı birimlerinin 19.7 en muhtemel sayı ülke çapında 0.009 arasında değişmektedir büyük yarar kaynak suyu pozitif örneklerin virüs konsantrasyonları (EMS) / L. Pozitif örneklerin Medyan ve ortalama konsantrasyonları 0.03 ve akan kaynak suları için 0.17 EMS / L, 0.01 idigöl ve rezervuarlarda gelenler için 0.07 EMS / L, ve yeraltı sularını 11 (2000/04/25 tarihli ICR Aux1 18 ay erişim veritabanından veri) kullananlar için 0,04-0,74 EMS / L. Ulusal yeraltı Bir USEPA çalışmanın olumlu örneklerin Virüs konsantrasyonları 0.009 2.12 bulaşıcı birimler / ortanca ve 0.13 ve 0.29 bulaşıcı birimler / L 8 ortalama konsantrasyonları ile L arasında değişmektedir. Pozitif yeraltı örneklerinde virüs konsantrasyonu akan akarsularda daha yüksek oldu. Bu çalışmalarda yeraltı kullanarak tesislerin çoğu karstik bölgelerde bulunan akiferlerinden su aldı. Bunlar, kireçtaşı ve kristalin bulunan olanlarla birlikte (kırık kaya) ayarlarınız diğer ayarlardan 8,15,16 daha yüksek virüs konsantrasyonlarını olması muhtemeldir. USEPA virüs yöntemleri yüzey suyunun 200 L 300 L (ICR) (1615 Yöntemi) ve yeraltı 17,18 1,000 L 1.500 L (ICR) (1615 Yöntem) örnekleme hacimleri belirtin. Ancak, daha kullanımı ilebüyük örnek hacimleri, çoğu yüzey ve yeraltı suyu numuneleri virüs 8,11,19,20 için negatiftir.
Yüzey sularında bulunan Virüsler içme suyu tüketicilere potansiyel sağlık riski oluşturmaktadır. Yüzey Suyu Arıtma Kural en az 4-log virüs konsantrasyonlarını azaltmak için yüzey suyu kullanan tüm arıtma tesisleri gerektirir. Hatta bir 4 log azalma, 0.0044 EMS / L kadar az kaynağı, su içinde enfekte edici virüs konsantrasyonunun, ortalama kalma ve tedavi koşullarına ve rotavirüs 11,21 için doz tepki parametrelerinin varsayarak günde bir enfeksiyona neden olabilir. Tedavi edilmeyen Sularda bulunan virüs riski nedeniyle tedavi ve viral oluşum eksikliği daha büyük olabilir. Borchardt ve arkadaşları erişkinlerde akut gastroenterit% 22 ve% 63 kadar çocuklarda daha az beş yıl işlenmemiş yeraltı sularını kullanarak 19 topluluklarda içme suyu virüs nedeniyle olabileceğini tahmin ediyoruz.
USEPA Mbu yöntemde, 1615 Borchardt bulgularına ve meslektaşları 19,23 takibi ulusal olarak düzensiz Kirletici İzleme Yönetmelik üçüncü izleme döngüsü (UCMR3) 22 sırasında enterovirüs ve Norovirus algılamak için geliştirilmiştir. USEPA yöntem öncelikle işlenmemiş yeraltı sularını kullanarak sistemlerde virüs ölçmek için tasarlanmış, ancak diğer su matris türlerini içerecek şekilde daha genel yazılmıştır. Yeni yöntem ICR 17 sırasında kullanılan önceki virüs yöntemiyle birçok bileşenleri koruyarak bir melez, moleküler prosedürlerin eklenmesi norovirusa 24 Borchardt ve ark. 19,23 ve ek primer setleri yöntemine dayalı. Bu yazının amacı örnekleme prosedürü ve toplama ve sevkiyat sırasında numunenin bütünlüğünü korumak için gerekli adımları tanımlamaktır. Genel yöntemin bir değerlendirme Cashdollar ve ark. 25 tarif edilmiştir. Bu protokol, basit alan collectio kapaklarıBir pompa ve ön filtre gerekli değildir ve ayarlamalar pH veya suyun içinde bir dezenfektan varlığı için gerekli değildir nerede yüzey ve yeraltı sularının n numune alınacak. daha karmaşık bir numune alma Fout ve ark. 17,18 tarif edilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çevre sularından virüsleri konsantre edilmesi için farklı filtre tipleri yıllar üzerinde 26 kullanılmıştır. Güncel yöntemler süzgeçleri 27, elektronegatif filtreler 13,28,29, cam yünü filtreleri 23 ve elektropozitif filtreler 30 istihdam. Elektronegatif filtreler yaygın olarak uzun yıllar kullanıldı, ancak tuz ilavesi ve önce veya örnekleme sırasında alanda su pH ayarlanması için bir gereklilik kendi yararını 13 sınırlar. alan örneklemesi için en pratik filtre seçimi elektropozitif filtreler olduğunu. Bu filtreler, yüksek akış hızlarında ve su herhangi bir klima olmaksızın suyun büyük hacimli örnekleme sağlar. Cam yünü filtreler en ucuz seçenek olmakla birlikte, elektropozitif filtrelerin daha yavaş akış oranları ve ticari olarak mevcut değildir. Ultrasüzgeçler su kalitesinin geniş bir ürün yelpazesi üzerinde en yüksek virüs kurtarma sağlar, ancak ekipman sampli için gerekling kolayca alan taşınabilir değildir ve örnekleri toplamak için gerekli süre 27 daha uzundur. Yöntem son zamanlarda kullanım alanına ayarlama ihtiyacını önlemek için elektronegatif filtreleri şartlandırılarak geliştirilmiştir, ancak bu büyük örnek hacimleri 28,29 toplamak için geçerli olmayabilir.
EPA Method 1615 alüminyum oksit nanolifler veya dörtlü aminler ya kendi pozitif yük almak elektropozitif kartuş filtreler kullanır. ikincisi üzerine eski avantajları, daha az pahalı olduğu ve etkili bir şekilde 30,31 değerleri doğal pH'ı geniş bir aralık üzerinde sularından virüsü toplar; Ancak, her kartuş, yanı sıra Borchardt ve arkadaşları tarafından kullanılan cam yünü filtreleri su 23,31,32 (Cashdollar, yayınlanmamış veriler) den Enterovirüs ve norovirusa benzer kurtarma verir. Kartuş filtreler örneklerin toplanması kolaylaştırmak için tasarlanmış basit bir örnekleme cihazı içine yerleştirilirve örnekleme sırasında kirlenmeyi azaltmak.
Büyük çalışmalar birden analitik laboratuvarları kullanarak yapılan zaman standart yöntemler paha biçilmezdir. EPA Method 1615 standart prosedürler ve bu toplanan verileri etkileyebilir iki büyük örnek toplama sorunları en aza indirmek için rehberlik sağlar çalışmalar-yanlış kirlenme örnek toplama sırasında veya yetersiz dezenfekte cihaz bileşenleri ve bileşenleri tarafından filtre gözeneklerin tıkanması kaynaklanan olumlu sonuçlar Su örneklenmiş olan.
Enterik virüsler nedeniyle yetersiz hijyen kişiden kişiye yayılabilir gibi, virüsler kontamine eldiven 33 ile kötü yıkanmış elleri veya elinden örneklerin içine sokulabilir. Bu numune potansiyel kirlenme yolları anlamak ve örnekleme sırasında aseptik tekniği kullanmak esastır. Nümune eldivenler öncelikle p maruz örnekleyicinin korumak için kullanılan ve olmadığını anlamak gerekirkirden cihazı rotect. Örnekleme ve bakım başlangıç kirlenmesini eldivenin el önlemek için eldiven giyilmesini sırasında alınmalıdır önce eller yıkanmalıdır. Onlar yüksek seviyelerde enterovirüsleri veya Noroviruses dökülme olabilir gibi gastroenterit veya solunum semptomları olan numune, numune toplamak olmamalıdır.
İkincisi, bakım, önceki örnekleme olaylardan virüsün taşınmasını önlemek için alınmalıdır. Kontaminasyon bu potansiyel kaynağını en aza indirmek için, yöntem 1615 yılında örnekleme cihazı giriş ve kartuş yuvası modülü arasında bir basınç regülatörü ve basınç ölçer içermemesiyle ICR, de modifiye edilmiştir. Örnekleme olaylar sırasında gözlenen basınçlar maksimum konut değerlendirmesi altında her zaman çünkü bu bileşenler çıkarıldı (örneğin, 125 5-inç kartuş muhafazaları için psi) ve dezenfekte etmek zor çünkü. İkinci sorun st ekipmanları boş kontrollerin kullanımı ile gösterildiUST 6,20 sonra udies. derecesi hangi ICR veri bilinmeyen etkilenen, ama büyük olasılıkla küçük oldu; Sadece iki yanlış pozitif negatif performans değerlendirme örnekleri çalışma sırasında vardı (veriler gösterilmemiştir). Ayrıca taşınmasını bulaşma olasılığını azaltmak için, aynı zamanda giriş modülü boru, her örnekleme olaydan sonra değiştirilmesi önerilir. Bu cihaz virüsü ile tohumlandı, kalite ya da performans kontrol için kullanılmıştır, eğer yeterli bir dezenfeksiyon sağlamak için özellikle önemlidir. Dezenfeksiyon uygulamadan önce, serbest klor konsantrasyonu depolama esnasında herhangi bir kayıp ölçülmelidir. Yukarıda tarif edilen düzeneğin konfigürasyonda ilgili değişimlere ek olarak, düzenli olarak ekipman boşlukları dezenfeksiyonun etkili olduğunu göstermek için çalıştırılabilir esastır. Yöntem 1615 ekipman boşlukları virüs tohumlu kontroller için kullanıldıktan sonra dezenfekte edilmiştir cihazları kullanılarak gerçekleştirilebilir görev, bu şekilde basitleştirilmesiihtiyacını ortadan kaldırarak prosedür dezenfeksiyon önce aygıt içinden bir virüs aşılanmış solüsyonun geçmek için. bu konsantrasyon, ekipman, herhangi uygun bir virüs deaktive etmek ve nükleik asitleri indirgeme her ikisi de gerekli olduğu gibi dezenfektan konsantrasyonu, Yöntem 1615 için 0.525% hipoklorit yükseltildi. Bu nedenle, ekipman boşlukları hücre kültürü ve qPCR deneyleri hem kullanılarak analiz edilmelidir.
Elektropozitif filtrelerin Her iki tür Tablo 1'de rapor çalışmaları sırasında tıkanma tabi tutulmuştur. Azaltılmış hacimli numune bilinmeyen sayısı, toplayıcı bir yanlış okuma veya başka karşılamak için örnekleme kasıtlı erken durağı olarak, bağlı örnekleme hataları olabilir Özellikle 20 NTU daha az bulanıklık okumaları ile sular için son tarih. tıkanma derecesi filtre tipi ve su kalite parametreleri üzerine hem bağlıdır. Önfiltreler bazı gelişmeler ölçüsünü sağlar, fakat kullanıldığında, işlenmiş ve analiz edilmelidirayrı elektropozitif filtreden. UCMR3 için geçerli tavsiye örnek en az yarım hacmi ilk filtre kullanılarak toplanan olabilir eğer iki alüminyum oksit nano-tabanlı filtreler kullanarak ön filtre olmadan tahsil edilmesi olduğunu.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar olan katkıları ICR ve sırasında yapılan izleme yapılan sayısız EPA personeline teşekkür mümkün UCMR3, bildirilen diğer EPA çalışmaların aşağıdaki kurşun araştırmacılar: Daniel Dahling, Alfred Dufour, Andrey Egorov, Susan Glassmeyer, Asja Korajkic, Richard Lieberman, Robert Safferman, Tim Wade; eleştirel bu yazının gözden Shannon Griffin ve Michael Ware ve. Yazarlar örnek toplama göstermek için kendi pompa evlerden birinin kullanımı için Indian Hill Su İşleri teşekkür ederim. Bu çalışma USEPA tarafından gözden ve yayına kabul olmasına rağmen, ille resmi Ajansı politikasını yansıtmayabilir. Ticari adları veya ticari ürünlerin Mansiyon kullanımı için onay ya da tavsiye niteliğinde değildir.
Materials
| Name of the reagent/Equipment | Company | Catalogue number | Comments/Description |
| 1-L polypropylene bottle | Nalgene | 2104-0032 | |
| Aluminum foil squares | Cole-Parmer | 06275-40 | |
| Autoclave | Steris | Amsco Lab Series | |
| Bubble wrap | U.S. Plastics | 50776 | |
| Closable bag | Uline | S-12283 | |
| Closable bag | Fisher Scientific | S31798C | |
| Commercial ice packs | Cole-Parmer | 06345-20 | |
| Cool safe box | Diversified Biotech | CSF-BOX | |
| Gauze sponge | Fisher Scientific | 22-415-469 | |
| Graduated cylinder | Cole-Parmer | 06135-90 | 4-L or larger |
| Hype Wipe | Fisher Scientific | 14-412-56 | |
| iButtons temperature data logger | Maxim | DS1921G | |
| Insulated storage and transport chest | Fisher Scientific | 11-676-12 | |
| Packing tape | U.S. Plastics | 50083 | |
| Portable chlorine colorimeter II test kit | Hach | 5870062 | |
| Portable pH and temperature probe | Omega | PHH-830 | |
| Portable turbidity meter | Omega | TRB-2020-E | |
| PTFE thread tape | Cole-Parmer | 08270-34 | Use on all threaded connections |
| Pump, Centrifugal Magnetic Drive | Cole-Parmer | 72010-20 | |
| Reduction nipple | Cole-Parmer | 06349-87 | |
| Sodium hypochlorite (NaClO) | Use locally available household bleach | ||
| Sodium thiosulfate (Na2S2O3) | Sigma Aldrich | 217247 | |
| Surgical gloves | Fisher Scientific | 19-058-800 | |
| Waterproof marker | Fisher Scientific | 22-290546 | |
| Media | Composition | ||
| 0.525% sodium hypochlorite (NaClO) | Prepare a 0.525% NaClO solution by diluting household bleach 1:10 in dH2O. Store 0.525% NaClO solutions for up to 1 week at room temperature. | ||
| 1 M sodium thiosulfate (Na2S2O3) pentahydrate | Prepare a 1 M solution by dissolving 248.2 g of Na2S2O3 in 1 L of dH2O. Store sodium thiosulfate for up to 6 months at room temperature. |
References
- Katayama, H., et al. One-year monthly quantitative survey of noroviruses, enteroviruses, and adenoviruses in wastewater collected from six plants in Japan. Water Res. 42 (6-7), 1441-1448 (2008).
- La Rosa, G., Pourshaban, M., Iaconelli, M., Muscillo, M. Quantitative real-time PCR of enteric viruses in influent and effluent samples from wastewater treatment plants in Italy. Annali Dell Istituto Superiore Di Sanita. 46 (3), 266-273 (2010).
- Sedmak, G., Bina, D., MacDonald, J. Assessment of an enterovirus sewage surveillance system by comparison of clinical isolates with sewage isolates from milwaukee, wisconsin, collected august 1994 to december 2002. Appl. Environ. Microbiol. 69 (12), 7181-7187 (1994).
- Berg, H., Lodder, W., van der Poel, W., Vennema, H., de Roda Husman, A. M. Genetic diversity of noroviruses in raw and treated sewage water. Res Microbiol. 156 (4), 532-540 (2005).
- Haramoto, E., et al. Seasonal profiles of human noroviruses and indicator bacteria in a wastewater treatment plant in Tokyo, Japan. Water Sci Technol. 54 (11-12), 301-308 (2006).
- Denis-Mize, K., Fout, G. S., Dahling, D. R., Francy, D. S. Detection of human enteric viruses in stream water with RT-PCR and cell culture. J Water Health. 2 (1), 37-47 (2004).
- Hamza, I. A., Jurzik, L., Stang, A., Sure, K., Uberla, K., Wilhelm, M. Detection of human viruses in rivers of a densly-populated area in Germany using a virus adsorption elution method optimized for PCR analyses. Water Res. 43 (10), 2657-2668 (2009).
- Lieberman, R. J., et al. . Microbial monitoring of vulnerable public groundwater supplies. , (2002).
- Parshionikar, S. U., et al. Waterborne outbreak of gastroenteritis associated with a norovirus. Appl. Environ. Microbiol. 69 (9), 5263-5268 (2003).
- Hewitt, J., Bell, D., Simmons, G. C., Rivera-Aban, M., Wolf, S., Greening, G. E. Gastroenteritis outbreak caused by waterborne norovirus at a New Zealand ski resort. Appl. Environ. Microbiol. 73 (24), 7853-7857 (2007).
- Shaw, S., Regli, S., Chen, J., Maguire, M. J., McLain, J. L., Odolensky, A. Virus occurrence and health risks in drinking water. Information Collection Rule Data Analysis. , 437-462 (2002).
- Sobsey, M. D., Wallis, C., Henderson, M., Melnick, J. L. Concentration of Enteroviruses from Large Volumes of Water. Appl Microbiol. 26 (4), 529-534 (1973).
- Hill, W. F., Akin, E. W., Benton, W. H., Metcalf, T. G. Virus in water. II. Evaluation of membrane cartridge filters for recovering low multiplicities of poliovirus from water. Appl Microbiol. 23 (5), 880-888 (1972).
- USEPA. 40 CFR Part 141 National Primary Drinking Water Regulations: Monitoring Requirements for Public Drinking Water Supplies; Final Rule. Federal Register. 61 (94), 141 (1996).
- Pang, L. Microbial removal rates in subsurface media estimated from published studies of field experiments and large intact soil cores. J Environ Qual. 38 (4), 1531-1559 (2009).
- Johnson, T. B., et al. Viruses and Bacteria in Karst and Fractured Rock Aquifers in East. Ground Water. 49 (1), 98-110 (2011).
- Fout, G. S., Schaefer, F. W., Messer, J. W., Dahling, D. R., Stetler, R. E. . ICR Microbial Laboratory Manual. , (1996).
- Fout, G. S., et al. . Method 1615: Measurement of enterovirus and norovirus occurrence in water by culture and RT-qPCR. , 1-91 (2012).
- Borchardt, M. A., Spencer, S. K., Kieke, B. A., Lambertini, E., Loge, F. J. Viruses in nondisinfected drinking water from municipal wells and community incidence of acute gastrointestinal illness. Environ Health Perspect. 120 (9), 1272-1279 (2012).
- Francy, D. S., Bushon, R. N., Stopar, J., Luzano, E. J., Fout, G. S. Scientific Investigations Report 2004-5219, U.S. Geological Survey. Environmental factors and chemical and microbiological water-quality constituents related to the presence of enteric viruses in ground water from small public water supplies in southeastern Michigan. , 1-54 (2004).
- Regli, S., Rose, J. B., Haas, C. N., Gerba, C. P. Modeling the Risk from Giardia and Viruses in Drinking-Water. Journal American Water Works Association. 83 (11), 76-84 (1991).
- USEPA. Parts 141 and 142 Revisions to the Unregulated Contaminant Monitoring Regulation (UCMR3) for Public Water Systems; Final Rule. Federal Register. 77 (85), 26072-26101 (2012).
- Lambertini, E., Spencer, S. K., Bertz, P. D., Loge, F. J., Kieke, B. A., Borchardt, M. A. Concentration of enteroviruses, adenoviruses, and noroviruses from drinking water by use of glass wool filters. Appl. Environ. Microbiol. 74 (10), 2990-2996 (2008).
- Butot, S., Le Guyader, F. S., Krol, J., Putallaz, T., Amoroso, R., Sanchez, G. Evaluation of various real-time RT-PCR assays for the detection and quantitation of human norovirus. J Virol Methods. 167 (1), 90-94 (2010).
- Cashdollar, J. L., et al. Development and Evaluation of EPA Method 1615 for Detection of Enterovirus and Norovirus in Water. Appl. Environ. Microbiol. 79 (1), 215-223 (2013).
- Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. J Appl Microbiol. 115 (1), 1-11 (2013).
- Rhodes, E. R., Hamilton, D. W., See, M. J., Wymer, L. Evaluation of hollow-fiber ultrafiltration primary concentration of pathogens and secondary concentration of viruses from water. J Virol Methods. 176 (1-2), 38-45 (2011).
- Katayama, H., Shimasaki, A., Ohgaki, S. Development of a virus concentration method and its application to detection of enterovirus and norwalk virus from coastal seawater. Appl. Environ. Microbiol. 68 (3), 1033-1039 (2002).
- Haramoto, E., Katayama, H., Utagawa, E., Ohgaki, S. Recovery of human norovirus from water by virus concentration methods. J Virol Methods. 160 (1-2), 206-209 (2009).
- Sobsey, M. D., Jones, B. L. Concentration of poliovirus from tap water using positively charged microporous filters. Appl. Environ. Microbiol. 37 (3), 588-595 (1979).
- Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water. Appl. Environ. Microbiol. 75 (8), 2393-2399 (2009).
- Ko, G., et al. Evaluation of electropositive filtration for recovering norovirus in water. J Water Health. 9 (1), 27-36 (2011).
- Liu, P., et al. Laboratory Evidence of Norwalk Virus Contamination Levels on the Hands of Infected Individuals. Appl. Environ. Microbiol. 79 (24), 7875-7881 (2013).
