Expressie van fluorescerende eiwitten in<em> Branchiostoma lanceolatum</em> Door mRNA Injectie in onbevruchte eicellen
Summary
Wij rapporteren hier de robuuste en efficiënte expressie van fluorescerende eiwitten na mRNA injectie in onbevruchte eicellen van Branchiostoma lanceolatum. De ontwikkeling van de micro-injectie techniek in deze basale chordate zal de weg voor vergaande technische innovaties in deze opkomende model systeem, met inbegrip van in vivo beeldvorming en gen-specifieke manipulaties effenen.
Abstract
We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.
Introduction
Tijdens de ontwikkeling van een enkele cel leidt tot een volledig organisme in een zeer complex proces dat zowel celdelingen en bewegingen omvat. Om beter te begrijpen van de biologische principes van de dynamiek van de cel gedrag, hebben ontwikkelingsbiologen begonnen met fluorescentie gebaseerde in vivo imaging technieken te gebruiken. Specifieke compartimenten van cellen, zoals celmembranen, kan hetzij door behandelingen worden gelabeld met fluorescente kleurstoffen, een benadering gehinderd door een gebrek aan specificiteit en weefselpenetratie 1 of de specifieke introductie in het embryo van exogeen mRNA coderend fluorescente proteïnen 2. Verschillende technieken kunnen worden gebruikt voor de efficiënte afgifte van exogene verbindingen, zoals mRNA. Deze omvatten, maar zijn niet beperkt tot, micro-injectie, elektroporatie, beschieting met microdeeltjes, lipofectie en transductie 3,4. Hoewel al deze benaderingen kan worden gebruikt om exogene verbindingen in een ingevoerdontwikkeling van het embryo, alleen micro-injectie kan de toepassing van vooraf gedefinieerde en precieze hoeveelheden in elke cel 3. Micro-injectie technieken zijn beschreven voor alle belangrijke ontwikkelings modelsystemen 4 (bijvoorbeeld, fruitvliegen, nematode wormen, zebravis, kikkers, muizen) en voor sommige alternatieve modellen 4, onder andere gebruikt voor vergelijkende studies gericht op het begrijpen van de evolutie van ontwikkelingsmechanismen (bv, zeeanemonen, annelid wormen, zee-egels, ascidian manteldieren, de Schedellozen amphioxus).
Cephalochordates, die samen met manteldieren en gewervelden vestigen de chordate phylum, zijn bijzonder goed geschikt modellen om de evolutie van chordadieren en de diversificatie van de gewervelde dieren van een ongewerveld voorouder 5-8 te bestuderen. De Schedellozen lineage afweken zeer vroeg tijdens chordate evolutie; en bestaande cephalochordates, die zijn onderverdeeld in drie geslachten (Branchiostoma, Asymmetron en Epigonichthys), lijken op gewervelde dieren, zowel in termen van algemene anatomie en genoom architectuur 5-8. Van de ongeveer 30 soorten cephalochordates die tot nu toe zijn beschreven, vijf zijn beschikbaar voor embryologische en ontwikkelingsstudies 6,9: Asymmetron lucayanum (de Bahama lancetvisje), Branchiostoma Floridae (de amphioxus Florida), Branchiostoma lanceolatum (de Europese amphioxus), Branchiostoma belcheri (de Chinese amphioxus) en Branchiostoma japonicum (de Japanse amphioxus). Rijpe volwassenen van drie van deze soorten (B. lanceolatum, B. belcheri en B. japonicum) kan worden geïnduceerd om te paaien on-demand tijdens het broedseizoen 10,11. Bovendien, althans voor B. lanceolatum kan een efficiënt paai ook geïnduceerd worden in kunstmatig zeewater 12, waardoor deze bijzondere Schedellozen soort toegankelijk voor laborator makenies die geen toegang tot natuurlijke zeewater hebben. De combinatie, in B. lanceolatum van een gemakkelijke en betrouwbare toegang tot embryo's met een efficiënte levering methode, zoals micro-injectie, tot nu toe de enige afgiftetechniek ontwikkeld amphioxus (zowel B. Floridae en B. belcheri) 13-15, zal de ontwikkeling van een mogelijk roman suite van manipulatieve technieken, waaronder lineage opsporings- en dynamische cel-gedrag-gebaseerde benaderingen.
Een protocol voor de efficiënte micro-injectie van mRNA naar fluorescerende eiwitten in de B. uitdrukken lanceolatum embryo werd dus ontwikkeld. Bovendien, om een basis toolkit voor live beeldvorming van B. bieden lanceolatum embryo, vector systemen ontwikkeld die membraangebonden en nucleaire expressie van fluorescerende eiwitten mogelijk. Voor membraan targeting, versterkt groen fluorescent proteïne (eGFP) werd gefuseerd met de humane HRAS CAAX box en nucleaire lokalisatie van mCherry en eGFP wasverkregen door fusie aan de zebravis histon 2B (H2B) exon (figuur 1, aanvullend bestand 1). Verder met als doel eiwittranslatie optimaliseren, de Kozak sequenties en codons van de constructen werden aangepast en afgestemd op gebruik in B. lanceolatum. Samen zullen de injectiemethode en expressievectoren hier gepresenteerde dienen als basis voor het genereren van nieuwe experimentele benaderingen voor cephalochordates name analyses met de nieuwste fluorescentie gebaseerde in vivo beeldvorming.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit artikel presenteren we voor het eerst een gedetailleerde en reproduceerbare protocol voor de injectie van B. lanceolatum eicellen die na B. Floridae 13,14 en B. belcheri 15, dus de derde amphioxus soorten waarvan dergelijke techniek is beschreven. Belangrijk is het protocol beschreven hier ook de beschrijving van vectorsystemen geschikt voor de productie van proteïnen B. lanceolatum van geïnjecteerde mRNA geproduceerd in vitro (hieronder beschre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag de steun van de "Animalerie Centrale de Gif-sur-Yvette" te erkennen voor de veehouderij. Dit werk werd ondersteund door fondsen van ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 en ANR-11-JSV2-002-01) aan Michael Schubert, door de Europese Unie KP6 subsidie "Embryomics" en door de ANR subsidie "ANR- 10-BLAN-121.801 Dev-proces "aan Jean-François Nicolas en Nadine Peyriéras. João Emanuel Carvalho wordt gefinancierd door een FCT doctoraatsbeurs (SFRH / BD / 86878/2012).
Verzoeken om de hier beschreven vectoren kunnen rechtstreeks worden gericht aan de auteurs.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Consumables | |||
| 35 mm Petri dishes | Falcon | 353001 | culture-treated |
| Filtration unit (Stericup 1L) | Fisher | W21719 | 0.22 micron filtration |
| Spin-X tubes | Costar | 8160 | 0.22 micron filtration tube |
| Needle storage jar for 1.2 mm diameter capillaries | WPI | E212 | |
| Pasteur Pipettes | 230 mm long | ||
| Aspiration tube | Dutscher | 75056 | |
| Capillaries for injection needles | Sutter | BF 120-94-10 | Borosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 mm |
| Reagents | |||
| Low-melting agarose | SIGMA | A9414 | |
| Phenol Red | SIGMA | 114537 | |
| Glycerol | SIGMA | G2025 | |
| Poly-L-Lysine hydrobromide | SIGMA | P9155 | |
| H2O Dnase, Rnase-free | Gibco | 10977-035 | |
| mMessage mMachine SP6 Transcription kit | Ambion | AM1340 | mRNA synthesis kit |
| Phenol pH8 | SIGMA | P4557 | |
| 24:1 chloroform:isoamylic alcohol | SIGMA | C0549 | |
| 5:1 phenol pH4.7:chloroform | SIGMA | P1944 | |
| Reef Crystal salts (200 kg) | Europrix | Commercial salts | |
| Equipment | |||
| Fluorescent dissecting scope with 200x magnification | Leica | MZ16F | 25x oculars, DSR and GFP2 filters |
| Micromanipulator | Marzhauzer | M-33 | |
| Injector | Picospritzer | model II or III | |
| Needle puller | Sutter | P97 | heating-filament needle puller |
| Fine forceps | FINE SCIENCE TOOLS GMBH | 11252-30 | Dumont #5 |
References
- Weber, T., Köster, R. Genetic tools for multicolor imaging in zebrafish larvae. Methods. 62, 279-291 (2013).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends. Cell. Biol. 20, 380-390 (2010).
- Zhang, Y., Yu, L. C. Microinjection as a tool of mechanical delivery. Curr. Opin. Biotechnol. 19, 506-510 (2008).
- Stepicheva, N. A., Song, J. L. High throughput microinjections of sea urchin zygotes. J. Vis. Exp. , e50841 (2014).
- Schubert, M., Escriva, H., Xavier-Neto, J., Laudet, V. Amphioxus and tunicates as evolutionary model systems. Trends Ecol. Evol. 21, 269-277 (2006).
- Bertrand, S., Escriva, H. Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus. Development. 138, 4819-4830 (2011).
- Holland, L. Z. Evolution of new characters after whole genome duplications: insights from amphioxus. Semin. Cell Dev. Biol. 24, 101-109 (2013).
- Lemaire, P. Evolutionary crossroads in developmental biology: the tunicates. Development. 138, 2143-2152 (2011).
- Yu, J. K., Holland, L. Z. Cephalochordates (amphioxus or lancelets): a model for understanding the evolution of chordate characters. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
- Fuentes, M., et al. Insights into spawning behavior and development of the European amphioxus (Branchiostoma lanceolatum). J. Exp. Zool. B. 308, 484-493 (2007).
- Li, G., Shu, Z., Wang, Y. Year-round reproduction and induced spawning of Chinese amphioxus, Branchiostoma belcheri, in laboratory. PLoS One. 8, e75461 (2013).
- Theodosiou, M., et al. Amphioxus spawning behavior in an artificial seawater facility. J. Exp. Zool. B. 316, 263-275 (2011).
- Holland, L. Z., Yu, J. K. Cephalochordate (amphioxus) embryos: procurement, culture, and basic methods. Methods Cell Biol. 74, 195-215 (2004).
- Holland, L. Z., Onai, T. Analyses of gene function in amphioxus embryos by microinjection of mRNAs and morpholino oligonucleotides. Methods Mol. Biol. 770, 423-438 (2011).
- Liu, X., Li, G., Feng, J., Yang, X., Wang, Y. Q. An efficient microinjection method for unfertilized eggs of Asian amphioxus Branchiostoma belcheri. Dev. Genes Evol. 223, 269-278 (2013).
- Harvey, K. J., Lukovic, D., Ucker, D. S. Membrane-targeted green fluorescent protein reliably and uniquely marks cells through apoptotic death. Cytometry. 43, 273-278 (2001).
- Maruyama, J., Nakajima, H., Kitamoto, K. Visualization of nuclei in Aspergillus oryzae with EGFP and analysis of the number of nuclei in each conidium by FACS. Biosci. Biotechnol. Biochem. 65, 1504-1510 (2001).
- Rupp, R. A., Snider, L., Weintraub, H. Xenopus embryos regulate the nuclear localization of XMyoD. Genes Dev. 8, 1311-1323 (1994).
- Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).
- Nakagawa, S., Niimura, Y., Gojobori, T., Tanaka, H., Miura, K. Diversity of preferred nucleotide sequences around the translation initiation codon in eukaryote genomes. Nucleic Acids Res. 36, 861-871 (2008).
- Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Res. 28, 292 (2000).
- Deheyn, D. D., et al. Endogenous green fluorescent protein (GFP) in amphioxus. Biol. Bull. 213, 95-100 (2007).
- Schubert, M., et al. Retinoic acid signaling acts via Hox1 to establish the posterior limit of the pharynx in the chordate amphioxus. Development. 132, 61-73 (2005).
- Schubert, M., Holland, N. D., Laudet, V., Holland, L. Z. A retinoic acid-Hox hierarchy controls both anterior/posterior patterning and neuronal specification in the developing central nervous system of the cephalochordate amphioxus. Dev. Biol. 296, 190-202 (2006).
- Yu, J. K., Holland, N. D., Holland, L. Z. Tissue-specific expression of FoxD reporter constructs in amphioxus embryos. Dev. Biol. 274, 452-461 (2004).
- Beaster-Jones, L., Schubert, M., Holland, L. Z. Cis-regulation of the amphioxus engrailed gene: insights into evolution of a muscle-specific enhancer. Mech. Dev. 124, 532-542 (2007).
- Holland, L. Z., et al. The amphioxus genome illuminates vertebrate origins and cephalochordate biology. Genome Res. 18, 1100-1111 (2008).
- Urasaki, A., Mito, T., Noji, S., Ueda, R., Kawakami, K. Transposition of the vertebrate Tol2 transposable element in Drosophila melanogaster. Gene. 425, 64-68 (2008).
- Li, G., et al. Mutagenesis at specific genomic loci of amphioxus Branchiostoma belcheri using TALEN method. J. Genet. Genomics. 41, 215-219 (2014).
- Zhang, Q. J., et al. Continuous culture of two lancelets and production of the second filial generations in the laboratory. J. Exp. Zool. B. 308, 464-472 (2007).
- Yasui, K., Igawa, T., Kaji, T., Henmi, Y. Stable aquaculture of the Japanese lancelet Branchiostoma japonicum for 7 years. J. Exp. Zool. B. 320, 538-547 (2013).
- Benito-Gutiérrez, E., Weber, H., Bryant, D. V., Arendt, D. Methods for generating year-round access to amphioxus in the laboratory. PLoS One. 8, e71599 (1371).
