ניתוח "מטען מיפוי" המאפיין את ההרכב מולקולרי מוטורס על העברת axonal מטענים שימוש

תחבורה תאית היא קריטית בכל סוגי התאים לאספקת חלבונים, ממברנות, האברונים, ומולקולות איתות לתחומים תאיים שונים ^1. נוירונים הם מאוד מיוחדים תאים עם תחזיות ארוכות, מקוטבות שהאנושות תלויה בתחבורה תאית של מטענים חיוניים למסירה למרחקים ארוכים שלהם לmicrodomains axonal השונים. תחבורה זה מתווכת על ידי kinesins וdyneins – שתי משפחות גדולות של חלבוני מנוע מולקולריים – לאגד את זה למטענים ולעקוב אחר לאורך microtubules המקוטב בכיוונים אנטרוגרדית ומדרדר, בהתאמה. בעוד שתנועת מדרדר בעיקר בתיווכו של dynein, תנועה בכיוון אנטרוגרדית היא הקלה על ידי משפחה גדולה, פונקציונלי מגוונת של מנועים kinesin. כתוצאה מכך, תחבורת האנטרוגרד מטעני axonal יכולה להיות מתווכת על ידי בני משפחה שונים של kinesin superfamily ^1-5. למרות שכמה מטענים לנוע בעקביות בכל כיוון, מ 'מטעני OST להעביר bidirectionally ולהפוך לעתים קרובות בדרכם ליעדים הסופיים שלהם ^1,5-13. יתר על כן, הוכח שמנועים של מתנגד לקשר יווניות בו-זמנית למטענים, להעלות את השאלה, כיצד תנועה מוסדרת מטענים מתואמת על ידי מנועים הפוכה-קוטביות ^5-7. יחד, הובלת מטעני axonal הוא תהליך מרוכז שמוסדר על ידי הרכב המנועים ופעילותם הספציפית ביוכימי, אשר בתורו תלויה במתאמים שונים ושותפים המחייבים רגולציה ^14.

נאמנות לתאר את המנגנון של תחבורת axonal למטען ספציפי ולחשוף את תקנה הבסיסית של תחבורה ש, זה הוא בעל חשיבות עליונה כדי לקבוע את ההרכב של חלבוני מנוע והשותפים המחייבים הרגולציה שלהם הקשורים למטענים בודדים במהלך הובלת החיות שלהם. שיטות אחרות, לגישות ביוכימיות דוגמא, מספקות הערכות של mot הממוצעאו יצירות על אוכלוסיות הטרוגניות שלפוחית ​​מטוהרת, אבל הערכות אלה אינן חושפות את הסוג או סכומים של מנועים הקשורים לשלפוחית ​​נעה אחת. כמו כן, הכינון מחדש של תחבורת שלפוחית ​​לאורך microtubules מוצר המורכב מראש במבחנה אפשר מדידת הכמות של סוג אחד של מנוע ברמה שלפוחית ​​אחת ^15. עם זאת, ניסויים אלה לא ישירות לתאם הסכום של מנועים עם מאפייני התחבורה של שלפוחית ​​אלה, ונמדדו תחבורה בהיעדר גורמים רגולטוריים סלולריים.

פרוטוקול מוצג כאן, הקובע את הרכב המנוע (סוג וכמות היחסית של מנועים) של שלפוחית ​​נעה בודדת מimmunofluorescence נתונים (IF) מדידה באופן אנדוגני הביעו חלבוני מנוע, וקושר פרמטרים אלה לתחבורה החי של בדיוק את אותו שלפוחית ​​בנוירונים ^16. שיטה זו כרוכה במיפוי מדויק של נתוני תנועת מטעני IF-כדי-לחיות. המטרה זו מושגת על ידי צומחנוירונים בהיפוקמפוס עכבר g במכשירי microfluidic הבאים הוקמו פרוטוקולי ^17-19. מכשירים אלה מאפשרים לזיהוי ולמתאם ("מיפוי") של אקסונים ומטענים מרגשים יחידים באופני מיקרוסקופ אור קבועים וחיים (איור 1). נוירונים בתרבית הם transfected עם חלבוני מטען שכותרתו fluorescently התחבורה שהוא צילם ברזולוציה מרחב ובזמן גבוהה כדי לקבל מידע מפורט תנועה שהוא להתוות kymographs. במהלך ההדמיה, הנוירונים קבועים עם paraformaldehyde, ולאחר מכן מוכתם עם נוגדנים כנגד חלבוני מנוע אנדוגני. תמונות מטען ומנוע קבועים על גבי זו kymographs תנועה החי ל" מפה "(colocalize) למטען החי תנועת מסלולי ^16. לתאם את התנועה החי של מטענים עם העמותה של חלבוני מנוע, colocalization מנותח באמצעות חבילת תוכנת MATLAB מותאמת אישית שנעשה בשם "מוטור colocalization ^"16,20. מטענים ומנועים שכותרתו fluorescently ליצור תכונות punctate עקיפה מוגבל שיכולים באופן חלקי חפיפה. כדי לפתור את המצב של חפיפת puncta, התוכנה ראשונה באופן אוטומטי מתאימה פונקציות גאוס לכל פונקצית נקודת התפשטות, המייצג puncta ניאון פרט, כדי לקבוע העמדה תת פיקסלים XY המדויקת שלהם מתאם ועוצמת אמפליטודות ^21-23. העמדות של מנועים ומטענים הן בהשוואה לאחר מכן לאחד את השני כדי לקבוע colocalization ^16,20. לכן, שיטה זו מדויקת יותר מקצה colocalization בין puncta הניאון בהשוואה לשיטות אחרות ^24.

כוחה של שיטה זו הוא היכולת להעריך את colocalization של מנועים עם מטען אישי בתאים קבועים, שלמסלולי תנועה חיים (למשל, לכיוון שבו הם נעים בזמן של קיבעון) היו recorded. בשיטה זו, kinesins וdyneins נמצאו לקשר בו-זמנית לשלפוחית ​​שנושא את חלבון הפריון הנורמלי (-cellular ^C PRP), מטען מועשר neuronally שזז bidirectionally או נשאר נייח באקסונים ^16. ניתוח זה אפשר גיבוש מודל עבודה להסדרת תנועת שלפוחית ​​PRP ^C שבי אנטרוגרדית (kinesin) ומנועים מדרדר (dynein) לתאם את פעילותם על מנת להעביר את שלפוחית ​​בכל כיוון או להישאר קבוע כאשר הקשורים למטען . כוח נוסף של שיטה זו הוא התחולה הרחבה הפוטנציאל שלה לאפיון colocalization / עמותת מטענים רבים שכותרתו fluorescently שנעים כמעט בכל סוג תא, עם כל חלבון אחר (ים) של עניין. כך, מתאם חי / קבוע עלול לאפשר זיהוי של אינטראקציות חלבון-מטען חולפים, fluorescently הבודד רב שכותרתו נע חלקיקים יכול להיות מנותח על p רצויeriod זמן. בהתחשב בתחולה הרחבה ואת סוג השאלות ששיטה זו יכולה לטפל, פרוטוקול זה יהיה עניין לקהל רחב של ביולוגים של תא כוללים אלה סחר הלימוד ותחבורה בתאי עצב או בסוגי תאים אחרים.