تميز التركيب الجزيئي للسيارات على محور عصبي نقل البضائع عن طريق "شحن رسم الخرائط" تحليل
Summary
Intracellular transport of cargoes, such as vesicles or organelles, is carried out by molecular motor proteins that track on polarized microtubules. This protocol describes the correlation of the directionality of transport of individual cargo particles moving inside neurons, to the relative amount and type of associated motor proteins.
Abstract
فهم الآليات التي المحركات الجزيئية تنسيق أنشطتهم لنقل البضائع حويصلي داخل الخلايا العصبية يتطلب التحليل الكمي للجمعيات المحرك / البضائع على مستوى حويصلة واحدة. الهدف من هذا البروتوكول هو استخدام المجهر مضان الكمي لربط ("الخريطة") موقف وتوجه حركة البضائع الحية إلى كميات تكوين والنسبية المحركات المرتبطة بنفس البضائع. "رسم الخرائط للشحن" يتكون من التصوير الحي للبضائع fluorescently المسمى تتحرك في محاور مثقف على أجهزة ميكروفلويديك، تليها تثبيت الكيميائي أثناء تسجيل الحركة الحية، والمناعي لاحق (IF) تلطيخ من نفس المناطق بالضبط محور عصبي مع الأجسام المضادة ضد المحركات. ويتم تقييم Colocalization بين الشحنات والمحركات المرتبطة بها من خلال تخصيص موقف الفرعي بكسل تنسق لقنوات السيارات والبضائع، من خلال وظائف جاوس مناسبة للحيود ليثيومmited انتشار نقطة ظائف يمثلون الفردية مصادر نقطة الفلورسنت. يتم فرضه البضائع والسيارات صور ثابتة لاحقا إلى قطع حركة البضائع، ل"الخريطة" لهم لتتبع مساراتها. قوة هذا البروتوكول هو مزيج من العيش وإذا كانت البيانات لتسجيل كل من نقل الشحنات حويصلي في الخلايا الحية وتحديد المحركات المرتبطة نفس هذه الحويصلات الدقيقة. هذه التقنية تتغلب التحديات السابقة التي تستخدم أساليب الكيمياء الحيوية لتحديد متوسط تكوين محرك تنقيته غير متجانسة السكان حويصلة بالجملة، لأن هذه الأساليب لا تكشف التراكيب على الشحنات المتحركة واحدة. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييف هذا البروتوكول لتحليل مسارات النقل و / أو الاتجار أخرى في أنواع الخلايا الأخرى لربط حركة هياكل داخل الخلايا الفردية مع تكوين البروتين. قيود من هذا البروتوكول هي إنتاجية منخفضة نسبيا نظرا لانخفاض كفاءة ترنسفكأيشن مثقفالخلايا العصبية الابتدائية وحقل المحدود المتاح لعرض عالية الدقة التصوير. ويمكن أن تشمل التطبيقات المستقبلية طرق لزيادة عدد الخلايا العصبية معربا عن الشحنات fluorescently المسمى.
Introduction
النقل داخل الخلايا أمر حاسم في جميع أنواع الخلايا لتسليم البروتينات والأغشية، والعضيات، والجزيئات يشير الى مختلف المجالات الخلوية 1. الخلايا العصبية وخلايا متخصصة للغاية مع طويلة، توقعات الاستقطاب التي تعتمد بشكل كبير على نقل البضائع داخل الخلايا الأساسية للتسليم لمسافات طويلة لمختلف microdomains محور عصبي. وتوسط هذا النقل kinesins وdyneins – عائلتين كبيرة من البروتينات المحركات الجزيئية – التي ترتبط وتتبع الشحنات على طول الأنابيب الدقيقة الاستقطاب في تقدمي ورجعية الاتجاهات، على التوالي. في حين تتوسط أساسا حركة تراجعية من قبل داينين، مما يسهل التحرك في الاتجاه تقدمي قبل الكبيرة، عائلة متنوعة من المحركات كينيسين وظيفيا. بالتالي، نقل البضائع تقدمي محور عصبي يمكن بوساطة مختلف أفراد الأسرة من الفصيلة كينيسين 1-5. على الرغم من بعض الشحنات تتحرك باستمرار في كلا الاتجاهين، مOST الشحنات تتحرك في الاتجاهين وعكس كثير من الأحيان في طريقهم إلى وجهاتهم النهائية 1،5-13. وعلاوة على ذلك، فقد تبين أن المحركات معارضة الاتجاهية الزميلة في وقت واحد لشحنات، مما يثير السؤال عن كيفية يتم تنسيق حركة البضائع الخاضعة للتنظيم من قبل محركات عكس القطبية 5-7. معا، نقل الشحنات محور عصبي هو عملية منسقة الذي ينظمه تكوين المحركات والأنشطة البيوكيميائية الخاصة بها، والتي بدورها تعتمد على محولات مختلفة وشركاء ملزم التنظيمي 14.
لوصف بأمانة آلية نقل المحاور لشحنة محددة والكشف عن التنظيم الكامن وراء هذا النقل، فإن من الأهمية بمكان لتحديد تكوين البروتينات الحركية وشركاء ملزم التنظيمي المرتبطة الشحنات الفردية خلال نقلها المباشر. أساليب أخرى، على سبيل المثال مناهج الكيمياء الحيوية، وتوفر تقديرات متوسط يذكرهأو التراكيب على النقى السكان حويصلة غير متجانسة، ولكن هذه التقديرات لا تكشف عن نوع أو كمية من المحركات المرتبطة الحويصلات واحدة متحركة. أيضا، إعادة تشكيل حويصلة النقل على طول الأنابيب الدقيقة مجمعة مسبقا في المختبر مكنت قياس كمية نوع واحد من السيارات على مستوى حويصلة واحدة 15. ومع ذلك، فإن هذه التجارب لا ترتبط بشكل مباشر على كمية من المحركات مع خصائص نقل تلك الحويصلات، وقياس النقل في غياب العوامل التنظيمية الخلوية.
بروتوكول يرد هنا، والذي يحدد تكوين المحرك (نوع وكمية النسبي للمحركات) من الحويصلات الانتقال من الفردية أعرب المناعي (IF) بيانات قياس التطور الطبيعي البروتينات الحركية، ويرتبط هؤلاء المعلمات إلى النقل المباشر لنفس الحويصلات بالضبط في الخلايا العصبية 16. ويستتبع هذا طريقة التعيين الدقيق لل-IF إلى العيش البيانات حركة البضائع. ويتم إنجاز ذلك من خلال growinز الخلايا العصبية قرن آمون في الماوس الأجهزة ميكروفلويديك بعد ثبوت بروتوكولات 17-19. هذه الأجهزة تسمح لتحديد والارتباط ("الخرائط") من المحاور والشحنات تتحرك واحدة في طرائق ضوء المجهر الثابتة والحية (الشكل 1). و transfected الخلايا العصبية مثقف مع fluorescently البروتينات المسماة البضائع التي تم تصويرها في القرار المكانية والزمانية عالية للحصول على معلومات مفصلة الحركة أن يتم رسم في kymographs النقل. أثناء التصوير، ويتم إصلاح الخلايا العصبية مع امتصاص العرق، وبعد ذلك الملون مع الأجسام المضادة ضد البروتينات الحركية الذاتية. يتم فرضه البضائع والسيارات صور ثابتة على kymographs الحركة الحية إلى "خريطة" (colocalize) لهم البضائع الحية مسارات حركة 16. لربط الحركة الحية للبضائع مع جمعية البروتينات الحركية، ويتم تحليل colocalization باستخدام العرف MATLAB حزمة برامج تسمى "موتور Colocalization "16،20. شحنات fluorescently المسمى ومحركات تولد محدودة حيود منقط الميزات التي يمكن أن تتداخل جزئيا. لحسم الموقف من نقاط ومتداخلة، البرنامج الأول تلقائيا يناسب ظائف جاوس إلى كل وظيفة انتشار نقطة، تمثل نقاط والفلورسنت الفردية، لتحديد موقف XY الفرعية بكسل دقة بهم تنسق وشدة سعة 21-23، ومواقف للسيارات والبضائع و بعد ذلك مقارنة مع بعضها البعض لتحديد colocalization 16،20. وبالتالي، هذا الأسلوب يكلف أكثر دقة colocalization بين نقاط والفلورسنت بالمقارنة مع الطرق الأخرى 24.
قوة هذه الطريقة هي القدرة على تقييم colocalization المحركات مع الشحنات الفردية في الخلايا الثابتة، والتي كانت مسارات الحركة الحية (على سبيل المثال، في الاتجاه الذي كانت تتحرك في وقت التثبيت) تفصيلأورديد. مع هذا الأسلوب، تم العثور على kinesins وdyneins لربط في الوقت نفسه إلى الحويصلات التي تحمل بروتين بريون العادي (بي ار بي -cellular C)، شحنة المخصب neuronally التي تتحرك في الاتجاهين أو تبقى ثابتة في 16 محاور. يسمح هذا التحليل في صياغة نموذج للعمل لتنظيم حركة C بي ار بي الحويصلة التي تقدمي (كينيسين) ورجعية (داينين) محركات تنسيق أنشطتها من أجل تحريك الحويصلات في كلا الاتجاهين أو أن تبقى ثابتة بينما المرتبطة البضائع . قوة أخرى هذه الطريقة هي إمكانية تطبيقه واسع محتمل للتميز colocalization / جمعية العديد من الشحنات fluorescently المسمى التي تتحرك في الواقع أي نوع من الخلايا، مع أي بروتين آخر (ق) من الفائدة. وبالتالي، يمكن أن يعيش / علاقة ثابتة يحتمل أن تسمح للكشف عن عابرة تفاعلات البروتين البضائع، العديد من الأفراد fluorescently المسمى تتحرك الجزيئات يمكن تحليلها على مدى ع المطلوبeriod من الزمن. نظرا لتطبيق واسع ونوع الأسئلة التي يمكن أن تعالج هذه الطريقة، فإن هذا البروتوكول تكون ذات فائدة لجمهور واسع من علماء الأحياء الخلايا بما في ذلك أولئك الذين يدرسون الاتجار والنقل في الخلايا العصبية أو في أنواع الخلايا الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول المعروضة هنا تمكن ارتباط الاتجاهية حركة الجزيئات الفردية الفلورسنت البضائع تتحرك على أساس أنيبيب مع نوع النسبي وكمية من البروتينات في الخلايا العصبية الحركية المرتبطة الحية. سابقا، كان يعاير إجمالي تكوين المحرك البضائع حويصلي محور عصبي على السك…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Ge Yang, Gaudenz Danuser, Khuloud Jaqaman, and Daniel Whisler for assistance with the adaptation and development of the software to quantitate cargo mapping analyses, and Emily Niederst for help in making the microfluidic devices. This work was supported in part by NIH-NIA grant AG032180 to L.S.B.G., and the Howard Hughes Medical Institute. L.S. was supported in part by a NIH Bioinformatics Training Grant T32 GM008806, S.E.E. was supported by a Damon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship, NIH Neuroplasticity Training Grant AG000216, and by a grant from The Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award, G.E.C was supported by an NIH/NCATS 1 TL1 award TR001114 and by the Achievement Rewards for College Scientists foundation.
Materials
| Reagent and Equipment Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899-20mg | |
| D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) High Glucose, w/ L-Glutamine, w/o Sodium Pyruvate (1X) | Life Technologies | 11965092 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | 10082147 | |
| Neurobasal-A Medium (1X) | Life Technologies | 10888022 | |
| B-27 Serum Free Supplement | Life Technologies | 10888022 | |
| GlutaMAX I Supplement (100X) | Life Technologies | 35050061 | |
| HBSS (1X) (Hank’s Balanced Salt Solution) | Life Technologies | 24020117 | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, no Magnesium, no Calcium (1X) | Life Technologies | 14190250 | |
| Penicillin/Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140122 | |
| Corning cellgro Water for Cell Culture | Fisher Scientific | MT46000CM | |
| Papain | USB Corporation | 19925 | |
| DL-cysteine HCl | Sigma-Aldrich | C9768 | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DNAse I grade II | Roche Applied Sciences | 10104159001 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| Formaldehyde Solution 16% EM Grade | Fisher Scientific | 50980487 | Caution: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to eyes, respiratory system and skin. Dispose according to official regulations. |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| HEPES | Sigma | H-3375 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-0121 | |
| BSA fatty acid and IgG free | Jackson Immuno Research | 001-000-162 | |
| Acetone | Fisher Scientific | BP2403-4 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | |
| Cover Glass 1 1/2. 24X40mm | Corning | 2980-244 | |
| Axis microfluidic device, 450 µm | Millipore | AX450 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | N/A | |
| Nikon Eclipse TE2000-U | Nikon | N/A | |
| Coolsnap HQ camera | Roper Scientific | N/A | |
| 60 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| 150 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-100 | |
| Antibodies Used: | |||
| Anti-Kinesin light chain, V-17 | Santa Cruz | sc-13362 | specificity verified using KLC1-/- neurons (Ref. 16 ), recommended dilution 1:100. |
| Anti Dynein Heavy Chain 1, R-325 | Santa Cruz | sc-9115 | specificity verified using shRNA against DYN1HC1 (Ref. 16), recommended dilution 1:100 |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody | Life Technologies | A10042 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A31573 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody IgG Antibody | Life Technologies | A11057 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A21447 | recommended dilution 1:200. |
| Plugins and Macros | |||
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/index.html. | ||
| ImageJ Kymoraph Plugin | http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html. |
References
- Goldstein, A. Y. N., Wang, X., Schwarz, T. L. Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components. Curr. Opin. Neurobiol. 18, 495-503 (2008).
- Hirokawa, N. Kinesin and dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport. Science. 279, 519-526 (1998).
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68, 610-638 (2010).
- Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 682-696 (2009).
- Welte, M. A. Bidirectional transport along microtubules. Curr. Biol. 14, 525-537 (2004).
- Bryantseva, S. A., Zhapparova, O. N. Bidirectional transport of organelles: unity and struggle of opposing motors. Cell. Biol. Int. 36, 1-6 (2011).
- Gross, S. P. Hither and yon: a review of bi-directional microtubule-based transport. Phys. Biol. 1, 1-11 (2004).
- Gross, S. P., et al. Interactions and regulation of molecular motors in Xenopus melanophores. J. Cell. Biol. 156, 855-865 (2002).
- Gross, S. P., Welte, M. A., Block, S. M., Wieschaus, E. F. Coordination of opposite-polarity microtubule motors. J. Cell. Biol. 156, 715-724 (2002).
- Kural, C., et al. Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement. Science. 308, 1469-1472 (2005).
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
- Shubeita, G. T., et al. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1107 (2008).
- Soppina, V., Rai, A. K., Ramaiya, A. J., Barak, P., Mallik, R. Tug-of-war between dissimilar teams of microtubule motors regulates transport and fission of endosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 19381-19386 (2009).
- Verhey, K. J., Hammond, J. W. Traffic control: regulation of kinesin motors. Nat Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 765-777 (2009).
- Hendricks, A. G., et al. Motor Coordination via a Tug-of-War Mechanism Drives Bidirectional Vesicle Transport. Current Biol. 20, 697-702 (2010).
- Encalada, S. E., Szpankowski, L., Xia, C. -. h., Goldstein, L. S. B. Stable kinesin and dynein assemblies drive the axonal transport of mammalian prion protein vesicles. Cell. 144, 551-565 (2011).
- Harris, J., et al. Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. 9 (410), (2007).
- Harris, J., et al. Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons. J Vis. Exp. 7 (261), (2007).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat. Methods. 2, 599-605 (2005).
- Szpankowski, L., Encalada, S. E., Goldstein, L. S. B. Subpixel colocalization reveals amyloid precursor protein-dependent kinesin-1 and dynein association with axonal vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 8582-8587 (2012).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat. Methods. 5, 695-702 (2008).
- Thomann, D., Dorn, J., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag localization II: Improvement in super-resolution by relative tracking. J. Microsc. 211, 230-248 (2003).
- Thomann, D., Rines, D. R., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag detection in 3D with super-resolution: application to the analysis of chromosome movement. J. Microsc. 208, 49-64 (2002).
- Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224, 213-232 (2006).
- Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. J. Vis. Exp. 29 (19), (2008).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Moore, D. S., McCabe, G. P. . Introduction to the Practice of Statistics. , (2005).
