Kullanımı Akson Kargo Hareketli Moleküler Motors Kompozisyon karakterize "Kargo Haritalama" Analizi
Summary
Intracellular transport of cargoes, such as vesicles or organelles, is carried out by molecular motor proteins that track on polarized microtubules. This protocol describes the correlation of the directionality of transport of individual cargo particles moving inside neurons, to the relative amount and type of associated motor proteins.
Abstract
Moleküler motorlar nöronların içindeki veziküler kargoları taşımak faaliyetlerini koordine hangi mekanizmaların anlaşılması tek kese düzeyde motor / kargo derneklerin kantitatif analizini gerektirir. Bu protokolün amacı, aynı yük ile ilgili motorların bileşim ve ilgili miktarları ("harita") ilişkili olduğu canlı yük hareket konumunu ve yönünü kantitatif floresan mikroskobu kullanmaktır. "Kargo haritalama" canlı canlı hareket kaydı sırasında kimyasal sabitleme takip microfluidic cihazlar üzerinde kültüre akson hareket floresan etiketli yükün görüntüleme, ve motorlar karşı antikorlar ile aynı aksonal bölgelerin sonraki immünoflüoresans (IF) boyama oluşur. Yükün ve bunların ilişkili motorlar arasındaki kolokalizasyon alt-piksel pozisyonunu atayarak değerlendirilir kırınım-li uydurma Gauss fonksiyonları tarafından, motorlu ve kargo kanalları koordinatlarıBireysel floresan nokta kaynaklarını temsil eden kişilere sınırsız bir puan farkı fonksiyonları. Sabit kargo ve motor görüntüleri sonradan izlenen yörüngeleri onları "harita", kargo hareket araziler için bindirilmiş. Veri canlı hücrelerde veziküler yüklerin taşınmasını hem kaydetmek ve bu aynı kesecikler ilişkili motorları belirlemek için IF Bu protokolün gücü canlı bir birleşimidir ve. Bu teknik, bu yöntemler tek hareketli yüklerin hakkında kompozisyonlar ortaya yok gibi, saflaştırılmış heterojen toplu vezikül nüfusun ortalama motorlu bileşimini belirlemek için biyokimyasal yöntemleri kullanmak önceki zorlukların üstesinden gelir. Ayrıca, bu protokol protein bileşimi ile tek tek hücre içi yapıların hareketini ilişkili diğer hücre tiplerinde başka nakil ve / veya değiş tokuş yollarına analizi için adapte edilebilir. Bu protokol sınırlamaları nedeniyle kültürlü düşük transfeksiyon verimliliği için nispeten düşük verimlilik vardırBirincil nöronlar ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme için kullanılabilir kısıtlı bir bakış alanı. Gelecekteki uygulamaları floresan etiketli yüklerin ifade nöronların sayısını artırmak için yöntemleri içerebilir.
Introduction
Hücre içi ulaşım çeşitli hücresel etki 1 Proteinlerin, membranlar, organeller ve sinyal moleküllerinin verilmesi için tüm hücre tiplerinde önemlidir. Nöronlar son derece eleştirel çeşitli aksonal microdomains onların uzun mesafe teslimat için gerekli yüklerin içi ulaşım bağlıdır uzun, polarize projeksiyonlar hücreleri uzmanlaşmıştır. Iki büyük moleküler motor proteinlerinin aileleri – – Bu taşıma kinesinlerin ve dyneins aracılık kargolara bağlanan ve sırasıyla ileriye ve retrograd yönlerde polarize mikrotübüllerinde boyunca izleyebilirsiniz. Geriye hareket esas olarak dinein aracılık ederken, ileriye doğrultuda hareket kinesin motorlarının büyük bir işlev olarak zengin etti kolaylaştınlır. Sonuç olarak, aksonal yüklerin ileriye taşıma kinesin'in süperailesinin 1-5 çeşitli aile üyeleri tarafından aracılık olabilir. Bazı yüklerin her iki yönde, m ısrarla hareket olsaost kargolar çift yönlü taşımak ve nihai hedeflere 1,5-13 yolunda sık sık ters. Ayrıca, gösterilmiştir ki, Yükün aynı anda yön önlisans karşıt yüklerin düzenlenmiş hareketi ters kutupluluk motorlar 5-7 koordine olarak nasıl soru yükselterek motorlar. Birlikte, aksonal yüklerin taşınması motorlar ve bu da çeşitli adaptörleri ve düzenleyici bağlama ortakları 14 bağlıdır kendi özel biyokimyasal faaliyetleri, bileşimin düzenlenir uyumlu bir süreçtir.
Sadakatle Belirli bir kargo için aksonal taşıma mekanizmasını tanımlamak ve bu ulaşım yatan düzenlenmesini ortaya çıkarmak için, onların canlı taşıma sırasında bireysel yüklerin ile ilişkili motor proteinlerin ve onların düzenleyici bağlama ortaklarından kompozisyonunu belirlemek için her şeyden önemlidir. Diğer yöntemler, örneğin biyokimyasal yaklaşımlar, ortalama mot tahminleri sağlamakya da saflaştırılmış heterojen vezikül popülasyonları üzerindeki kompozisyonlar, ancak bu tahminler türünü veya tek hareketli kesecikler ilişkili motorların miktarlarda ortaya çıkarmak değil. Aynı zamanda, in vitro olarak, önceden monte edilmiş mikrotübüller boyunca vezikül taşıma yeniden yapılandırılması tek vezikül seviyesinde 15 motorun bir tipinin miktarının ölçülmesi sağladı. Bununla birlikte, bu deneyler, doğrudan bu veziküllerin taşıma vasıfları olan motorlara miktarı korele olur ve hücre düzenleyici faktörler yokluğunda taşıma ölçülen değildi.
Endojen olarak ölçüm (IF) verileri, motor proteinleri ifade, bağışıklık tek tek hareket veziküllerin motor bileşimi (tip ve motorlar göreceli miktarı) belirler ve nöronlarda aynı veziküllerin canlı taşınması için bu parametreleri ilişkilendirir, burada sunulan bir protokol 16. Bu yöntem IF-to-live kargo hareketi verilerinin hassas haritalama gerektirir. Bu growin ile gerçekleştirilmektedirmikroakışkan cihazlarda g hipokampal fare nöronları protokolleri 17-19 kurdu aşağıdakiler. Bu cihazlar, sabit ve canlı ışık mikroskobu modaliteleri akson ve tek hareketli yüklerin tanımlanması ve korelasyon ("haritalama") (Şekil 1) için izin verir. Kültürlü nöronların, taşıma kymographs çizilir ayrıntılı hareket bilgilerini almak için yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlükte görüntülü floresan etiketli kargo proteinleri ile aktarılır. Görüntüleme sırasında, nöronlar paraformaldehit ile sabitlenmiştir ve daha sonra endojen motor proteinlerinin karşı antikor ile boyanmıştır. Sabit kargo ve motor görüntüleri hareketi 16 yörüngeleri canlı kargo onları "map" (colocalize) canlı hareket kymographs üzerine bindirilmiş. Motor proteinlerinin dernek ile yüklerin canlı hareketini korelasyon, kolokalizasyon "Mo adlı bir özel yapılmış MATLAB yazılım paketi kullanılarak analiz edilirtor kolokalizasyon "16,20. Floresan etiketli kargolar ve motorlar üst üste kısmen olabilir kırınım-sınırlı noktasal özellikleri oluşturmak. Puncta örtüşen konumunu gidermek için, yazılım ilk otomatik olarak hassas XY alt-piksel konumunu belirlemek için, bireysel floresan puncta temsil eden her bir nokta yayılım fonksiyonu Gauss fonksiyonları uyuyor koordine ve yoğunluğu 21-23 genliği. Motorlar ve yük pozisyonları Daha sonra ko 16,20 belirlemek için birbirleri ile karşılaştırılmıştır. Bu yüzden, bu yöntem, daha doğrusu diğer yöntemlerle 24 ile karşılaştırıldığında floresan puncta arasındaki ko atar.
Bu yöntemin gücü canlı hareketi yörüngeleri (örneğin, yön ise bu tespitin anda hareket edilmiştir) kyt edilmiş olan sabit hücrelerin tek tek yük motorlarda ko değerlendirmek için yeteneğidirorded. Bu yöntemle, kinesinler ve dyneins (PrP Cı -Hücresel) çift yönlü hareket eden ya da akson 16 sabit olarak kalan bir nöronal olarak zenginleştirilmiş yük, normal prion proteinini yapmak vesiküller eş zamanlı olarak ilişkilendirmek için bulunmuştur. Bu analiz kargo ile ilişkili iken anterograde (kinesin) ve retrograd (dinein) motorlar iki yönde veziküllerin hareket etmek veya sabit kalması amacıyla faaliyetlerini koordine edildiği PrP C vezikül hareketinin düzenlenmesi için bir çalışma modeli formülasyonunu izin . Bu yöntemin diğer bir gücü herhangi diğer ilgi protein (ler) ile birlikte, hemen hemen herhangi bir hücre tipi içinde hareket birçok floresan işaretli Yükün ko / ilişkiyi karakterize etmek için potansiyel, geniş uygulanabilmesidir. Bu nedenle, bir çok canlı / sabit bir ilişki potansiyel geçici protein yük etkileşimleri saptanması için izin verebilir, hareketli parçalardan etiketli birçok bireysel flüoresan istenen bir p fazla analiz edilebilirzaman dönemdedir. Geniş uygulanabilirliği ve bu yöntem hitap edebilecek sorular tipi göz önüne alındığında, bu protokol nöronlar veya diğer hücre tiplerinde bu eğitim kaçakçılığı ve ulaşım dahil olmak üzere hücre biyologlar geniş bir kitleye ilgi olacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan protokol canlı nöronların göreli türü ve ilgili motor proteinlerin miktarı ile bireysel floresan mikrotübül tabanlı hareket eden kargo parçacıkların hareketinin yönlülük korelasyon sağlar. Daha önce, aksonal veziküler yüklerin toplam motorlu kompozisyon biyokimyasal olarak arıtılan veziküllerin ve organellerin 9,15 heterojen toplumlarda denendi. Ancak, hücre içi kargo tek bir türü için karakterize motorlu kompozisyon, çünkü homojen vezik…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Ge Yang, Gaudenz Danuser, Khuloud Jaqaman, and Daniel Whisler for assistance with the adaptation and development of the software to quantitate cargo mapping analyses, and Emily Niederst for help in making the microfluidic devices. This work was supported in part by NIH-NIA grant AG032180 to L.S.B.G., and the Howard Hughes Medical Institute. L.S. was supported in part by a NIH Bioinformatics Training Grant T32 GM008806, S.E.E. was supported by a Damon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship, NIH Neuroplasticity Training Grant AG000216, and by a grant from The Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award, G.E.C was supported by an NIH/NCATS 1 TL1 award TR001114 and by the Achievement Rewards for College Scientists foundation.
Materials
| Reagent and Equipment Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899-20mg | |
| D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) High Glucose, w/ L-Glutamine, w/o Sodium Pyruvate (1X) | Life Technologies | 11965092 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | 10082147 | |
| Neurobasal-A Medium (1X) | Life Technologies | 10888022 | |
| B-27 Serum Free Supplement | Life Technologies | 10888022 | |
| GlutaMAX I Supplement (100X) | Life Technologies | 35050061 | |
| HBSS (1X) (Hank’s Balanced Salt Solution) | Life Technologies | 24020117 | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, no Magnesium, no Calcium (1X) | Life Technologies | 14190250 | |
| Penicillin/Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140122 | |
| Corning cellgro Water for Cell Culture | Fisher Scientific | MT46000CM | |
| Papain | USB Corporation | 19925 | |
| DL-cysteine HCl | Sigma-Aldrich | C9768 | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DNAse I grade II | Roche Applied Sciences | 10104159001 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| Formaldehyde Solution 16% EM Grade | Fisher Scientific | 50980487 | Caution: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to eyes, respiratory system and skin. Dispose according to official regulations. |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| HEPES | Sigma | H-3375 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-0121 | |
| BSA fatty acid and IgG free | Jackson Immuno Research | 001-000-162 | |
| Acetone | Fisher Scientific | BP2403-4 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | |
| Cover Glass 1 1/2. 24X40mm | Corning | 2980-244 | |
| Axis microfluidic device, 450 µm | Millipore | AX450 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | N/A | |
| Nikon Eclipse TE2000-U | Nikon | N/A | |
| Coolsnap HQ camera | Roper Scientific | N/A | |
| 60 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| 150 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-100 | |
| Antibodies Used: | |||
| Anti-Kinesin light chain, V-17 | Santa Cruz | sc-13362 | specificity verified using KLC1-/- neurons (Ref. 16 ), recommended dilution 1:100. |
| Anti Dynein Heavy Chain 1, R-325 | Santa Cruz | sc-9115 | specificity verified using shRNA against DYN1HC1 (Ref. 16), recommended dilution 1:100 |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody | Life Technologies | A10042 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A31573 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody IgG Antibody | Life Technologies | A11057 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A21447 | recommended dilution 1:200. |
| Plugins and Macros | |||
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/index.html. | ||
| ImageJ Kymoraph Plugin | http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html. |
References
- Goldstein, A. Y. N., Wang, X., Schwarz, T. L. Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components. Curr. Opin. Neurobiol. 18, 495-503 (2008).
- Hirokawa, N. Kinesin and dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport. Science. 279, 519-526 (1998).
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68, 610-638 (2010).
- Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 682-696 (2009).
- Welte, M. A. Bidirectional transport along microtubules. Curr. Biol. 14, 525-537 (2004).
- Bryantseva, S. A., Zhapparova, O. N. Bidirectional transport of organelles: unity and struggle of opposing motors. Cell. Biol. Int. 36, 1-6 (2011).
- Gross, S. P. Hither and yon: a review of bi-directional microtubule-based transport. Phys. Biol. 1, 1-11 (2004).
- Gross, S. P., et al. Interactions and regulation of molecular motors in Xenopus melanophores. J. Cell. Biol. 156, 855-865 (2002).
- Gross, S. P., Welte, M. A., Block, S. M., Wieschaus, E. F. Coordination of opposite-polarity microtubule motors. J. Cell. Biol. 156, 715-724 (2002).
- Kural, C., et al. Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement. Science. 308, 1469-1472 (2005).
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
- Shubeita, G. T., et al. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1107 (2008).
- Soppina, V., Rai, A. K., Ramaiya, A. J., Barak, P., Mallik, R. Tug-of-war between dissimilar teams of microtubule motors regulates transport and fission of endosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 19381-19386 (2009).
- Verhey, K. J., Hammond, J. W. Traffic control: regulation of kinesin motors. Nat Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 765-777 (2009).
- Hendricks, A. G., et al. Motor Coordination via a Tug-of-War Mechanism Drives Bidirectional Vesicle Transport. Current Biol. 20, 697-702 (2010).
- Encalada, S. E., Szpankowski, L., Xia, C. -. h., Goldstein, L. S. B. Stable kinesin and dynein assemblies drive the axonal transport of mammalian prion protein vesicles. Cell. 144, 551-565 (2011).
- Harris, J., et al. Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. 9 (410), (2007).
- Harris, J., et al. Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons. J Vis. Exp. 7 (261), (2007).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat. Methods. 2, 599-605 (2005).
- Szpankowski, L., Encalada, S. E., Goldstein, L. S. B. Subpixel colocalization reveals amyloid precursor protein-dependent kinesin-1 and dynein association with axonal vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 8582-8587 (2012).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat. Methods. 5, 695-702 (2008).
- Thomann, D., Dorn, J., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag localization II: Improvement in super-resolution by relative tracking. J. Microsc. 211, 230-248 (2003).
- Thomann, D., Rines, D. R., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag detection in 3D with super-resolution: application to the analysis of chromosome movement. J. Microsc. 208, 49-64 (2002).
- Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224, 213-232 (2006).
- Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. J. Vis. Exp. 29 (19), (2008).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Moore, D. S., McCabe, G. P. . Introduction to the Practice of Statistics. , (2005).
