Che caratterizza la composizione molecolare di motori su Moving assonale Cargo Utilizzo dell'analisi "Cargo Mapping"

Trasporto intracellulare è fondamentale in tutti i tipi di cellule per la consegna di proteine, membrane, organelli e molecole di segnalazione a diversi domini cellulari ^1. I neuroni sono altamente specializzati cellule con lunghi, proiezioni polarizzate che critica dipendono da trasporto intracellulare dei carichi essenziali per la loro consegna a lunga distanza per vari microdomini assonale. Questo trasporto è mediata da kinesins e dineine – due grandi famiglie di proteine ​​motore molecolare – che si legano ai carichi e tenere traccia lungo i microtubuli polarizzati in anterograda e retrograda direzioni, rispettivamente. Mentre il movimento retrogrado è mediata principalmente da dineina, il movimento in direzione anterograda è facilitato da una famiglia numerosa e funzionale gamma di motori kinesin. Di conseguenza, il trasporto anterogrado di carichi assonale potrebbe essere mediata da vari membri della famiglia della superfamiglia kinesin ^1-5. Sebbene alcuni carichi muovono costantemente in entrambe le direzioni, mcarichi ost si muovono in modo bidirezionale e invertono spesso nel loro cammino verso la loro destinazione finale ^1,5-13. Inoltre, è stato dimostrato che i motori di opporsi direzionalità collegata simultaneamente a carichi, sollevando la questione di come il movimento regolato di carichi è coordinata da motori opposto polarità ^5-7. Insieme, il trasporto di carichi assonale è un processo concertato che è regolato dalla composizione dei motori e delle loro attività biochimiche specifiche, che a loro volta dipendono da vari adattatori e partner di legame normativi ^14.

Per descrivere fedelmente il meccanismo di trasporto assonale per un carico specifico e per scoprire la regolazione di fondo di tale trasporto è fondamentale per determinare la composizione di proteine ​​motore e dei loro partner di legame regolamentazione associati con i singoli carichi durante il trasporto di animali vivi. Altri metodi, ad esempio approcci biochimici, forniscono stime di mot mediao composizioni su popolazioni purificate vescicole eterogenee, ma queste stime non rivelano il tipo o la quantità di motori associati a vescicole si muovono singoli. Inoltre, la ricostituzione del trasporto delle vescicole lungo i microtubuli preassemblati in vitro abilitata la misurazione della quantità di un tipo di motore su un unico livello vescicole ^15. Tuttavia, questi esperimenti non correlavano direttamente la quantità di motori con caratteristiche di trasporto di questi vescicole, e misurato il trasporto in assenza di fattori regolatori cellulari.

Un protocollo è presentato qui, che determina la composizione del motore (tipo e la quantità relativa di motori) delle vescicole spostano singoli da immunofluorescenza (IF) dati di misura endogenamente espressi proteine ​​motrici, e correla questi parametri al trasporto vivo degli stessi esatti vescicole in neuroni ^16. Questo metodo comporta precisa mappatura dei dati IF-to-live il movimento del carico. Questo si ottiene growing neuroni dell'ippocampo di topo in dispositivi microfluidici seguenti protocolli ^17-19 stabiliti. Questi dispositivi consentono l'identificazione e la correlazione ("mappatura") degli assoni e dei singoli carichi in movimento in modalità microscopia luce fissa e dal vivo (Figura 1). Neuroni in coltura sono trasfettate con modo fluorescente proteine ​​cargo con etichetta il cui trasporto è ripreso ad alta risoluzione spaziale e temporale per ottenere le informazioni dettagliate movimento che viene tracciata in kymographs. Nel corso delle immagini, i neuroni sono fissate con paraformaldeide, e successivamente colorate con anticorpi contro proteine ​​motrici endogene. Del carico e del motore le immagini fisse sono sovrapposte su kymographs dal vivo movimento di "mappare" (colocalizza) li al carico dal vivo movimento traiettorie ^16. Per correlare il movimento in tempo reale dei carichi con l'associazione di proteine ​​motrici, co-localizzazione viene analizzato utilizzando un pacchetto software MATLAB su misura chiamato "Motor Colocalizzazione ^"16,20. Carichi e motori fluorescente generano caratteristiche puntiformi diffrazione limitata che può parzialmente sovrapporsi. Per risolvere la posizione di sovrapposizione puncta, il software prima adatta automaticamente funzioni gaussiane a ciascuna funzione del punto di diffusione, che rappresenta puncta fluorescente individuale, per determinare la loro esatta posizione XY sub-pixel di coordinate e l'intensità ampiezze ^21-23. Le posizioni dei motori e dei carichi sono successivamente confrontate tra loro per determinare colocalizzazione ^16,20. Pertanto, questo metodo assegna più precisamente colocalizzazione tra puncta fluorescenza rispetto ad altri metodi ^24.

La forza di questo metodo è la capacità di valutare la colocalizzazione dei motori con carico individuale cellule fissate, per cui traiettorie di movimento vivo (ad esempio, la direzione in cui sono stati in movimento al momento della fissazione) sono stati recorded. Con questo metodo, kinesins e dineine trovato associare simultaneamente vescicole che portano il normale proteina prionica (PrP ^C -cellular), un carico neuronally arricchito che si sposta bidirezionalmente o rimane stazionario negli assoni ^16. Questa analisi ha permesso la formulazione di un modello di lavoro per la regolazione della PrP ^C movimento delle vescicole in cui anterograda (cinesina) e (dineina) Motori retrogradi coordinano le loro attività al fine di spostare le vescicole in entrambe le direzioni o di rimanere fermo mentre associato al carico . Un'altra forza di questo metodo è la sua applicabilità potenziale massima per caratterizzare colocalizzazione / associazione di molti carichi fluorescente che si muovono in qualsiasi tipo di cellula, con qualsiasi altra proteina (s) di interesse. Così, in diretta correlazione / fisso potrebbe potenzialmente consentire la rilevazione di interazioni transienti proteina-carico, come molti fluorescente individuo etichettato particelle in movimento può essere analizzato su un p desideratoeriodo di tempo. Data l'ampia applicabilità e il tipo di domande che questo metodo può affrontare, questo protocollo sarà di interesse per un vasto pubblico di biologi cellulari, tra cui quelli che studiano il traffico e il trasporto nei neuroni o in altri tipi di cellule.