Caractériser la composition de moteurs moléculaires sur les moyens axonale Cargo Utilisation de l'analyse "Cargo Mapping"

Le transport intracellulaire est essentiel dans tous les types de cellules pour la délivrance de protéines, les membranes, les organelles et les molécules de signalisation cellulaire à divers domaines ^1. Les neurones sont des cellules spécialisées avec très longues, projections polarisés qui dépendent de façon critique sur le transport intracellulaire des cargaisons essentielles pour leur livraison sur de longues distances à différents microdomaines axonales. Ce transport est médiée par kinésines et dynéines – deux grandes familles de protéines motrices moléculaires – qui se lient à des cargaisons et de suivre le long des microtubules polarisés en antérograde et rétrograde directions, respectivement. Alors que le mouvement rétrograde est principalement médiée par la dynéine, le mouvement dans le sens antérograde est facilitée par une grande famille, la diversité fonctionnelle de moteurs de kinésine. Par conséquent, le transport antérograde des cargaisons axonales pourrait être médiée par divers membres de la famille de la superfamille kinésine ^1-5. Bien que certaines cargaisons se déplacent constamment dans les deux sens, ma plupart des cargaisons se déplacent de manière bidirectionnelle et inversent souvent sur ​​leur chemin vers leurs destinations finales ^1,5-13. En outre, il a été démontré que les moteurs d'opposition à directivité associé simultanément à cargaisons, ce qui soulève la question de savoir comment le mouvement réglementé de cargaisons est coordonné par des moteurs de polarité opposée ^5-7. Ensemble, le transport de cargaisons axonales est un processus concerté qui est réglementée par la composition de moteurs et de leurs activités biochimiques spécifiques, qui sont à leur tour dépendent de divers adaptateurs et partenaires de liaison de réglementation ^14.

Pour décrire fidèlement le mécanisme de transport axonal pour une marchandise spécifique et à découvrir la réglementation sous-jacente de ce transport, il est primordial de déterminer la composition des protéines de moteur et de leurs partenaires de liaison réglementaires inhérents aux cargaisons individuelles lors de leur transport direct. D'autres méthodes, par exemple des approches biochimiques, fournissent des estimations de mot moyenneou compositions sur les populations de vésicules hétérogènes purifiés, mais ces estimations ne révèlent pas le type ou la quantité de moteurs associés à des vésicules mobiles simples. En outre, la reconstitution de transport le long des microtubules vésicule préassemblés in vitro a permis de mesurer la quantité d'un type de moteur à un niveau de ¹⁵ vésicule unique. Toutefois, ces expériences ne sont pas corrélés directement la quantité de moteurs avec des caractéristiques de transport de ces vésicules, et le transport mesurées en l'absence de facteurs de régulation cellulaire.

Un protocole est présentée ici, qui détermine la composition de moteur (type et la quantité relative des moteurs) de vésicules mobiles individuels à partir d'immunofluorescence (IF) des données de mesure de manière endogène exprimé protéines motrices, et en corrélation de ces paramètres pour le transport direct des mêmes vésicules exactes dans les neurones ^16. Cette méthode implique une cartographie précise des données SI-à-vivre mouvement de la cargaison. Ceci est accompli en growing neurones de l'hippocampe de souris dans des dispositifs microfluidiques qui suit les protocoles établis, ^17-19. Ces dispositifs permettent l'identification et la corrélation ("mapping") des axones et des cargaisons mobiles simples dans les modalités fixes et vivantes microscopie de lumière (Figure 1). Des neurones en culture sont transfectées avec des protéines par fluorescence de fret marqués dont le transport est imagée à une résolution spatiale et temporelle pour obtenir des informations détaillées mouvement qui est tracée dans kymographs. Au cours de l'imagerie, les neurones sont fixées avec du paraformaldéhyde, et ensuite colorées avec des anticorps dirigés contre des protéines endogènes à moteur. Images de fret et moteurs fixes sont superposées sur kymographs de déplacement en live à la «carte» (colocalisent) les à la cargaison vivante mouvement trajectoires ^16. Pour corréler le mouvement des cargaisons en direct avec l'association de protéines motrices, colocalisation est analysée en utilisant un logiciel MATLAB sur mesure appelé «MoTor colocalisation ^"16,20. Cargaisons et les moteurs marqués par fluorescence génèrent caractéristiques ponctuées limitée par la diffraction qui peuvent se chevaucher partiellement. Pour résoudre la position de chevauchement points lacrymaux, le logiciel adapte automatiquement la première gaussiennes pour chaque fonction d'étalement de point, représentant puncta fluorescent individu, afin de déterminer leur position précise sous-pixel de coordonnées XY et l'intensité des amplitudes de ^21-23. Les positions des moteurs et des cargaisons par la suite par rapport à l'autre afin de déterminer la colocalisation ^16,20. Par conséquent, cette méthode attribue plus précisément entre les points lacrymaux colocalisation fluorescente par rapport à d'autres méthodes ^24.

La force de cette méthode est la capacité d'évaluer la colocalisation des moteurs à cargaison individuelle dans des cellules fixées, pour qui les trajectoires de mouvement vivants (par exemple, la direction dans laquelle ils se déplaçaient au moment de la fixation) ont été recorded. Avec cette méthode, les kinésines et dynéines ont été trouvés à la fois pour associer les vésicules qui transportent la protéine prion normale ^(PrPc -cellular), une cargaison enrichi neuronale qui se déplace de façon bidirectionnelle ou reste stationnaire dans les axones ^16. Cette analyse a permis l'élaboration d'un modèle de travail pour la réglementation de la PrP ^C mouvement des vésicules dans lequel antérograde (kinésine) et (dynéine) moteurs rétrogrades coordonnent leurs activités afin de passer les vésicules dans les deux sens ou rester stationnaire pendant associée à la cargaison . Un autre point fort de cette méthode est son large potentiel d'application pour la caractérisation de colocalisation / association de nombreuses marchandises marquées par fluorescence qui se déplacent dans pratiquement n'importe quel type de cellule, avec toute autre protéine (s) d'intérêt. Ainsi, la corrélation en temps réel / fixe pourrait potentiellement permettre la détection d'interactions protéine-cargo transitoires, comme beaucoup individu marqué par fluorescence des particules en mouvement peut être analysé sur une p désiréeériode de temps. Compte tenu de la large applicabilité et le type de questions que cette méthode peut résoudre, ce protocole sera d'intérêt pour un large public de biologistes cellulaires, y compris ceux qui étudient le trafic et le transport dans les neurones ou dans d'autres types de cellules.