Karakteriseren van de Samenstelling van moleculaire motoren op Moving Axonale Cargo Met behulp van "Cargo Mapping" Analyse

Intracellulair transport is essentieel in alle celtypes voor de afgifte van eiwitten, membranen, organellen, en signaalmoleculen verschillende cellulaire domeinen ^1. Neuronen zijn zeer gespecialiseerd cellen met lange, gepolariseerde projecties die belangrijke mate afhangen van intracellulaire transport van essentiële goederen voor hun lange afstand levering aan diverse axonale microdomeinen. Dit transport wordt gemedieerd door kinesins en dyneins – twee grote families van de moleculaire motor eiwitten – die binden aan ladingen en spoor langs gepolariseerd microtubuli in anterograde en retrograde richtingen, respectievelijk. Terwijl retrograde beweging wordt voornamelijk gemedieerd door dynein, wordt beweging in de anterograde richting vergemakkelijkt door een groot, functioneel diverse familie van kinesine motors. Bijgevolg kunnen anterograde transport van axonale ladingen worden gemedieerd door verschillende familieleden van de kinesine superfamilie ^1-5. Hoewel sommige ladingen bewegen voortdurend in beide richtingen, most ladingen bewegen bidirectioneel en reverse vaak op hun weg naar hun eindbestemming ^1,5-13. Verder is aangetoond dat de motoren van de tegengestelde gerichtheid associate gelijktijdig tot lading, het verhogen van de vraag hoe gereglementeerde beweging van ladingen wordt gecoördineerd door tegenovergestelde polariteit motoren ^5-7. Samen axonale transport van lading is een gecoördineerde proces dat wordt gereguleerd door de samenstelling van motoren en hun specifieke biochemische activiteiten, die op hun beurt afhankelijk van diverse adapters en regelgevende bindingspartners ^14.

Trouw beschrijven mechanisme van axonaal transport voor een bepaalde lading en de onderliggende regulering van dat transport ontdekken, is het noodzakelijk dat de samenstelling van motorische eiwitten en hun regulatorische bindingspartners geassocieerd met individuele goederen tijdens het vervoer van levende bepalen. Andere methoden, zoals biochemische benaderingen schattingen over gemiddelde motof samenstellingen op gezuiverd heterogene blaasje populatie, maar deze schattingen niet het type of de bedragen van de motoren gekoppeld aan enkele bewegende blaasjes onthullen. Ook reconstitutie van vesicle transport langs voorgemonteerde microtubules in vitro geactiveerd meten van de hoeveelheid van een type motor op een vesicle level ^15. Echter, deze experimenten niet direct correleren het aantal motoren van de transporteigenschappen van deze vesicles en transport gemeten in afwezigheid van cellulaire regulerende factoren.

Een protocol wordt hier gepresenteerd, waarvan de motor samenstelling (type en de relatieve hoeveelheid van de motoren) van de afzonderlijke bewegende blaasjes uit immunofluorescentie (IF): gegevens die endogeen tot expressie motor eiwitten bepaalt, en correleert deze parameters om het vervoer van levende exact dezelfde blaasjes in neuronen ^16. Deze methode is gebaseerd op een nauwkeurige kartering van IF-to-live-beweging vracht gegevens. Dit wordt bereikt door growing hippocampus muis neuronen in microfluïdische systemen, volgens vastgestelde protocollen ^17-19. Deze apparaten zorgen voor de identificatie en correlatie ("mapping") van axonen en enkele bewegende lading in vaste en live lichtmicroscopie modaliteiten (Figuur 1). Gekweekte neuronen worden getransfecteerd met fluorescent gelabelde lading eiwitten waarvan het transport wordt afgebeeld op een hoge ruimtelijke en temporele resolutie te gedetailleerde informatie beweging die is uitgezet in kymographs verkrijgen. Tijdens beeldvorming wordt neuronen gefixeerd met paraformaldehyde, en vervolgens gekleurd met antilichamen tegen endogene eiwitten motor. Vaste lading en motorische beelden worden gelegd op live-beweging kymographs naar "kaart" (colocaliseren) hen naar de live-beweging vracht trajecten ^16. Om de live-beweging van ladingen met de vereniging van motorische eiwitten correleren, is colocalization geanalyseerd met behulp van een op maat gemaakte MATLAB software pakket genaamd "Motor colokalisatie ^"16,20. Fluorescent gelabelde ladingen en motoren genereren buigingsbegrensd punctate functies die gedeeltelijk kunnen overlappen. Om de positie van overlappende puncta lossen, eerst de software past automatisch Gaussische functies aan elke puntspreidingsfunctie, wat neerkomt op individuele fluorescerende puncta, om hun precieze XY sub-pixel-positie te bepalen coördineert en intensiteit amplitudes ^21-23. De posities van motoren en ladingen zijn vervolgens vergeleken met elkaar colocalization ^16,20 bepalen. Daarom is deze werkwijze nader kent colocalization tussen fluorescente puncta vergelijking met andere methoden ^24.

De kracht van deze methode is het vermogen om de colocalization motoren met individuele lading beoordelen gefixeerde cellen, waarvoor levende beweging trajecten (bijvoorbeeld de richting waarin zij bewegen bij de fixatie) zijn rec geweestorded. Met deze methode werden kinesins en dyneins vond gelijktijdig koppelen aan blaasjes die het normale prioneiwit dragen (PrP ^C -cellular), een neuronaal verrijkt lading die in twee richtingen beweegt of stilstaat in axonen ^16. Deze analyse liet de formulering van een werkmodel voor de regulering van PrP ^C blaasje beweging waarin anterograde (kinesine) en retrograde (dynein) motoren hun activiteiten coördineren om de blaasjes te verplaatsen in beide richtingen of stationair te blijven, terwijl in verband met de lading . Een ander sterk punt van deze methode is het potentieel brede toepasbaarheid voor het karakteriseren van colocalization / vereniging van vele fluorescent gelabelde ladingen die in bewegen vrijwel elk type cel, met een andere proteïne (s) van belang. Zo zou levende / vaste correlatie mogelijk maakt detectie van voorbijgaande proteïne-lading interacties kan zoveel afzonderlijke fluorescent gelabelde bewegende deeltjes worden geanalyseerd over een gewenst period van tijd. Gezien de brede toepasbaarheid en de aard van de vragen die deze methode kan pakken, zal dit protocol van belang zijn voor een breed publiek van cel biologen waaronder die studeert handel en transport in neuronen of in andere celtypen.