Neuropathogenic의 비 침습 모델<em> 대장균</em> 신생아 쥐에 감염

본 연구에서 수행되는 모든 동물 실험은 국내 및 유럽 법률을 본 및 약국의 UCL 대학의 윤리위원회와 영국 홈 오피스 (HO)에 의해 승인되었다. HO 프로젝트에서 수행 된 모든 동물의 작업은 PPL 2천2백43분의 80과 PPL 7천7백73분의 70 라이센스. 1. 쥐 준비 무균 위 스타 신생아 쥐를 사용하는 모든 생체 실험을 수행하십시오. 21 ° C, 45 – – 55 % 습도, 15-20 공기 변화 / 시간 및 최적의 조건 (19에서, – (11 주 오래 된 여성 9) 자신의 양모 개별 케이지에있는 모든 쥐 새끼 (식민지 당 12 신생아를) 유지 12 시간 명 / 암주기). 2. 박테리아 세포 준비 스토어 E. -80 ° C에서 20 % (v / v) 글리세롤에서 대장균 K1 주식. 각각의 실험을 위해, 접시 한천 뮬러 – 힌튼 (MH) 위에 재고 세균을 판, 37 ° CO / N 부화. 먹이, inocu 전날하나의 E.와 MH 국물의 후반 10 ml의 대장균 K1 식민지 문화 O / 37 ° C, 200 rpm에서 N. 매체 오염 컨트롤로서 uninoculated MH 액체 배지 10 ㎖를 준비하고, 200 rpm에서 37 ° C에서 배양한다. 전송 MH 액체 배지 9.9 ml를으로 O / N 세균 현탁액 100 ㎕ (1 : 100 v / v)로하고, 중간 지수 상 0.6의 광학 농도에 대응하여, 도달 할 때까지 37 ° C, 200 rpm에서 부화 600 nm의 (OD 600)의 파장에서 측정. E.와 신생아 쥐의 3 급지 대장균 K1 조심스럽게 입을 열 수 있도록, 목덜미에서 한 손으로 수직으로 동물을 잡아. 천천히 동물의 입에 멸균 피펫 팁을 삽입하고 30 초 기간 동안 동물의 입에 접종 (~ 37 ° C)의 피펫 20 μL. 즉시 공급 한 후 어머니에 동물을 돌려줍니다. 8 × 10 6 박테리아 t을 공급 한 – (4)가 있는지 확인O 시리얼 PBS에서 접종의 희석과 MH 한천 플레이트에 잡아 내 각 강아지. E.에 의해 식민 4. 평가 대장균 K1 부드럽게 목덜미에서 한 손으로 동물을 잡아. 멸균 PBS에 멸균 면봉을 적셔 부드럽게 항문 주위 영역을 채취. 바로 보라고 한 후 어머니에 동물을 돌려줍니다. 멸균 PBS 300 μl를 포함하는 튜브에 면봉 팁을 놓고 얼음에 저장합니다. PBS에서 시리얼 희석 가능한 박테리아의 수를 결정하고 맥 콘키 배지 플레이트에 도금. 가능한 E.를 결정 박테리오파지 감수성 검사에 의한 대장균 K1. 멸균 미생물 루프를 사용하여 개별 식민지를 선택, 와류 혼합에 다음 주제 멸균 PBS 200 μL로 감소했다. 직선으로 MH 한천 위에 멸균 미생물 루프, 하위 문화를 사용. 판은 30 초 동안 건조하고 혈중 알코올 농도의 10 μl를 피펫 허용teriophage의 K1E 라인의 중심 상 (109 플라크 단위 / ㎖ (PFU / ㎖)을 형성 함). 37 ° C에서 판 O / N을 품어. 다음 날, 박테리오파지 매개 용해에 대한 판을 검사합니다. 질병 심각도 5. 평가 표 1에 요약 7 점의 점수 시스템을 사용하여 5 회 일일 – 4 각 동물의 중증도를 평가. 동물 점수가 7에서 ≥3 경우, 즉시 고통을 최소화하기 위해 동물을 추려. 죽은 동물을 기록합니다. 신생아 쥐와 혈액 수집 6. Euthanization 부드럽게 머리와 목을 노출, 한 손으로 동물을 잡아. 알코올 면봉으로 닦아 동물의 목을 소독. 미량의 에탄올을 제거하는 멸균 PBS로 세정 전에 70 % 에탄올을 사용하여 위의 큰 쌍 소독. 조심스럽게 페트리 접시 위에 직접 동물을 누르고 있습니다. 날카로운 surgi를 사용하여 신생아 목을 벨혈액 배양 접시에 똑똑 떨어지는 것을 보장 칼 가위,. 피부 식물과 혈액의 오염을 방지하기 위해 머리와의 접촉을 피하십시오. 즉시 멸균 피펫을 사용하여 혈액을 수집하고 (20)의 농도로 헤파린 나트륨 염과 혼합 – 0.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 50 단위 / ㎖. PBS에서 시리얼 희석 가능한 박테리아의 수를 결정하고 맥 콘키 배지 플레이트에 도금. 가능한 E.의 수를 결정 박테리오파지 K1E에 가능한 세균의 감수성을 테스트하여 대장균 K1. 7. 해부 신생아 쥐의 잘린 후, 절제와 관심의 조직을 수집하기 위해 무균 조건을 사용합니다. 70 % 에탄올과 멸균 PBS에서 (그림 1) 모든 악기를 씻으십시오. 해부 보드를 청소하고 70 % 에탄올로 완전히 복부 젖은. 왼쪽 뒷다리에 피닝의 뒷면에있는 시체를 놓고 (I)에 의해 해부 보드에 고정멸균 바늘 동작 테이블, (ⅱ) 시체 스트레칭 동작 테이블 우측 앞다리 피닝, (ⅲ) 작업 테이블 오른쪽 뒷다리와 좌측 앞다리 피닝. 집게를 사용 하복부의 왼쪽 측면을 따라 피부를 당겨, 박리 한 후 작은 가위를 사용 흉골 하복부로부터 시체의 왼쪽을 따라 절단. 흉골에 걸쳐 절제를 확장 한 다음 기본 구조 중에 손상되지 않도록 보장하는 집게와 작은 해부 가위를 사용하여 하복부에 흉골에서 시체의 오른쪽, 아래로. 마지막으로, 부드럽게 복막을 노출 홍채 곡선 해부 집게를 사용하여 복부에 흉골에서 피부 덮개를 아래로 당깁니다. 기본 장기 중에 손상되지 않도록 보장, 부드럽게 집게로 복막을 제기하고 내부 장기를 노출 수직으로 잘라. 8. 수집GI 요로 위, 소장, 맹장, 결장 및 장간막 림프 시스템을 확인합니다. 부드럽게 양쪽에에 병행하여 배를 제거한 다음 멸균 집게를 사용하여 멸균 PBS의 1.6 ml의를 포함하는 장식품에 배치합니다. 직장에서 콜론을 가로로 쪼개다. 조심스럽게 멸균 페트리 접시에 해부 포셉과 장소를 사용하여 시체에서 전체 장 질량을 당깁니다. 장 구조 및 장간막 림프 구조가 분리되지 않도록이 부드럽게 수행되었는지 확인합니다. GI 요로 및 장간막 림프 시스템 9. 분리 (그림 2) GI 관이 완전히 잠기 보장 페트리 접시로 멸균 PBS 30 ㎖에 붓고. 장간막 림프 시스템의 중심 질량을 식별하고 미세 해부 집게를 사용 꼬집어. 소장의 가장 근위부를 식별하고 미세 해부 집게를 사용 꼬집어. 천천히 센트라를 당겨장간막 림프계 및 두 조직까지 반대 방향 말단부 소장 리터 매스 서로 완전히 분리된다. 이 근위부, 중간 및 말단 지역의 재현 수집을 방지로, 작은 창자가 늘어되지 않도록주의하여이 과정을 수행합니다. (300)에 장간막 림프 시스템을 배치 – 멸균 PBS 500 μL와 얼음에 배치합니다. GI 요로 10. 단면 결장로부터 소장을 분리 맹장에서 GI 트랙트를 횡단면. (300)에 결장 장소 – 500 μL 멸균 PBS를 얼음에 배치합니다. 소장의 근위 중간 및 말단 지역의 대표 조직을 수집합니다. 중앙으로부터 소장을 맞 춥니 다. 이어서, (i)는 원위 소장 등 맹장에 앞서 조직의 마지막 2cm를 수집, (ⅱ) 5 내지 조직 수집 – 근위 소장 등의 중간 지점 위에 7 센티미터, 및중간 소장 등 중간 지점 아래 5 센티미터 – (III) 3의 조직을 수집합니다. 11. 간 수집 위의 제거 후 쥐의 간 세 로브를 식별합니다. 멀리 미세 해부 집게를 사용하여 복강에서 로브를 당깁니다. 미세 가위를 사용하여 부착하는 인대를 절단하여 간을 제거합니다. 얼음에 500 ㎕의 멸균 PBS 및 장소 – (300) 간을 놓습니다. 12. 비장 수집 비장을 확인합니다. 멀리 배에서 비장을 당겨 gastrosplenic 인대를 잘라 미세 가위를 사용합니다. 얼음에 500 ㎕의 멸균 PBS 및 장소 – (300)에 비장를 놓습니다. 제 12 항에있어서, 상기 신장을 수집 위장관 및 다른 장기의 제거시 복강의 뒤쪽에 가시 상태가 신장을 확인합니다. 컷 요관 및 부착 인대 U미세 해부 가위를 노래하고 미세 집게를 사용하여 신장을 제거합니다. 부신 및 미세 집게 및 해부 가위를 사용하여 (아직도 붙어있는 경우) 지방산 물질을 제거합니다. 300 ~ 500 ㎕의 멸균 PBS에 모두 신장을 놓고 얼음에 배치합니다. 14. 뇌를 수집 잘린 후, 곡선 집게를 사용하여 수직으로 머리를 잡아. 종 곡선 집게의 또 다른 세트를 사용하여 머리 꼭대기에 피부를 꼬집어, 미세 해부 가위를 사용하여 절개를. 목 근처에 남아있는 피부, 다시 길이 방향으로 미세 해부 가위를 잘라. 미세 해부 가위를 사용하여 피부 플랩을 두개골을 공개하고 제거하기 위해 양쪽에 미세 집게를 사용하여 바깥 방향으로 피부를 당겨. 척추 개방에 미세 해부 가위를 놓고 연단쪽으로 두개골을 따라 절개를합니다. 미세 집게를 사용하여 바깥 방향으로 두개골의 양쪽 부분을 잡아 당깁니다. 두개골 세그먼트를 제거하기 위해 잘라. <l난> 연단을 향해 척추 오프닝에서 위쪽으로 떠서 동작을 사용하여, 폭 넓은 집게를 사용하여 뇌를 제거합니다. 잘린 절차에서 모든 혈액을 제거하기 위해 두 번 PBS의 뇌를 씻으십시오. 15. 조직 처리 및 균질화 멸균 PBS를 포함하는 튜브에 생존 횟수 또는 DNA 추출, 장소 조직을 필요로하는 실험. 즉시 단기 20 % 글리세롤과 -20 ° C에서 시리얼 PBS에 희석과 맥 콘키 배지 플레이트에 도금, 또는 상점에서 가능한 박테리아의 수를 결정합니다. DNA 추출, -20 ° C에서 저장 조직 용. RNA 추출, RNAlater 솔루션의 적절한 볼륨으로 장소 조직 (1 MG 조직 당 10 μL)을 필요로하는 실험을 위해, 다음 단기 또는 -80 ° C 장기 기억에서 -20 ° C에 바로 저장할 수 있습니다. 10 ml의 용액에 Methacarn 촬상이 필요한 실험 도시 조직 (60 % 메탄올, 30 %의 클로로포름, 10 % 아세트산)의 경우, 다음을 저장할T RT – 최대 3 주 (20 ~ 25 ° C에서). 전 조직의 첨가 한 후 튜브의 무게를 비교하여 조직의 무게를 계산합니다. 균질기를 사용하여 조직을 균질화. 각 시료의 균질화 사이에 멸균 PBS에 한 번 70 % 에탄올에 두 번 균질을 씻으십시오. NOTE : Methacarn 고정술 뮤신 관련 점막 방어 구조를 보존하기 위해 장내 샘플의 고정을 위해 바람직하다; 포르말린 고정 전신 조직에 사용될 수있다.