Anbau von Säugetierzellen mit einem Einweg-Bioreaktorsystem Pneumatische
Summary
Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.
Abstract
Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor’s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.
Introduction
Zellen, die in Suspension wachsen, Zellen, die als Zuschlagstoffe zu wachsen, und die Zellen, die mit einem Substrat verankert wachsen: Säugerzelllinien können in eine von drei Kategorien auf der Basis ihrer Wachstumseigenschaften klassifiziert werden. Obwohl die Luft-Rad-Bioreaktor, in diesem Video gezeigt, in der Lage, alle drei Arten von Zellen wachsen, wird dieses Video Verwendung des Bioreaktors zur Verankerung abhängigen Zellen auf Mikroträgern wachsen zu demonstrieren. Wobei die Zellen selbst sind das Produkt – verankerungsabhängigen Säugetierzellen können zum Zwecke der Herstellung von mehr Zellen gezüchtet werden. Beispielsweise menschlichem Knochenmark abgeleiteten mesenchymalen Stammzellen werden zur Zeit mit dem Zweck der Ernte der Zellen und deren Injektion in die erkrankte Gewebe kultiviert. Der pneumatische Bioreaktor in diesem Video gezeigt hat für die Herstellung solcher mesenchymaler Stammzellen für diese Anwendung als geeignet erwiesen (Serra et al., Persönliche Mitteilung, 2013).
Anchorage dependent Säugetierzellen werden in der Regel gewachsen kleinen Maßstab in 2D Kulturgefäße wie Zellkulturplatten, Zellkulturflaschen oder Rollerflaschen, wo sie auf eine speziell behandelte Oberfläche 1 Wachstum zu halten. Wenn mehrere Zellen erwünscht sind, können die Platten oder Flaschen durch Verwendung von mehr oder größere Gefäße erweitert werden. Aber für kostengünstigere Kultivierung großer Mengen von verankerungsabhängigen Zellen, wodurch die Oberfläche für die Zellanheftung kann mit kleinen festen Kügelchen genannte Mikroträgern durchgeführt werden. In Abhängigkeit von den Bindungsmerkmalen der Zelle gibt verschiedene Arten von Mikroträger im Handel erhältlich, wie Dextran, ein Peptid oder Kollagen beschichtet ist. Mikroträger haben eine große Oberfläche im Verhältnis zum Volumen bietet eine größere Fläche für das Zellwachstum; und die Mikroträger in Suspension unter Rühren, das die Zellen zu hohen Dichten in Bioreaktorsystemen 2 kultiviert werden können beibehalten werden. Derzeit sind die Arten von bioreactors wo adhärenten Zellen auf Mikroträgern gewachsen sind Spinnerflaschen und Rührkessel-Systeme, die axiale Laufräder verwenden, um Aussetzung der Zelle resistenten Mikrounternehmen zu erhalten.
Mehrere Faktoren sind wichtig für die erfolgreiche Kultivierung von Zellen, einschließlich der Sauerstoffspannung, Scherspannung, Oberflächenmatrix und Nährstoff-und Metabolit-Konzentrationen. Die Verwendung von Bioreaktoren ermöglicht die Echtzeitüberwachung der Wachstumsbedingungen und der Potential signifikant niedrigeren Produktionskosten 1. Es gibt verschiedene Designs Bioreaktor für in-vitro-Zellkultivierung einschließlich gerührten Suspension, rotierenden Wandgefäß, Hohlfaser-, Beutel-Bioreaktor auf einer Wippe Plattform und Wirbelschichtsysteme 3. Viele dieser Systeme präsentieren einzigartige Probleme für die Zellkultivierung und skalieren -up, wie hohe Kosten, Nährstoff Konzentrationsgradienten, hydrodynamische Scher, Zellaggregation und Schwierigkeiten bei der Probennahme, Überwachung und Steuerung cell Scale-up.
Verschiedene adhärenten Zelllinien sind in der Herstellung von Viren, entweder bei der Herstellung von viralen Impfstoffen oder zur Herstellung viraler Vektoren für die Gentherapie-Anwendungen verwendet. In diesem Video mit dem einmaligen Gebrauch pneumatische (Luft-Rad) Bioreaktorsystem, zeigen wir die Kultur der Menschenlungenkarzinomzellen (A549) Zellen auf Mikroträgern für die Produktion eines onkolytischen Adenoviren. Der pneumatische Bioreaktor Design verwendet eine vertikale Bewegung Rad, das durch den Auftrieb des Gases in dem Boden des Bioreaktors gespült angetrieben wird. Diese sanfte Methode begrenzt Rühren hydrodynamische Scherkräfte, aber immer noch gewährleistet eine optimale Medium und Zell Mischen von 4. Im Vergleich zum Rührkessel, hat die pneumatische Reaktor geringer Wandschubspannung auch bei hoher Lautstärke Air-Rad-Bioreaktorsystemen (Abbildung 1). Im Gegensatz zu Rührkesselreaktoren, wird die vertikale Laufrad dieser einmaligen Gebrauch Reaktor durch einen Strom von Gasblasen innerhalb gedrehtDas Schiff, das für die schonende und gleichmäßige Durchmischung Medium (Abbildung 2) ermöglicht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Einweg-Bioreaktor-System ist relativ einfach zu bedienen und bietet Echtzeit-Analysen für Reaktor Überwachung und Analyse. Es ist sehr gut für Säugetier und Insektenzellkultur mit Zelldichten erreicht über 30 Millionen Zellen / ml geeignet. Außer in diesem Bericht beschriebenen 11 A549-Zellen, haben wir SF-9 Insektenzellen im Bioreaktor als auch gewachsen. Die schonende Durchmischung durch den pneumatischen Luft Rad vorgesehen reduziert Zellschäden. Mehrere Schritte sind entscheidend bei der Einrichtung dieses Reaktors. Zuerst richtige Kalibrierung des pH und Sauerstoffsensoren ist für eine optimale Kontrolle der Kultur und für die Zugabe von Reagenzien, um den pH oder die Sauerstoff in dem System anzupassen. Zweitens muss das Reagenz und Saatgut Flaschen gefüllt werden, und die Luer-Anhänge in einer sterilen Umgebung, wie einem BSC. Sobald die Reagenzien sind aus der sterilen Umgebung bewegt wird, müssen die Anschlüsse an den Bioreaktor Zuleitungen mit Sorgfalt vorgenommen werden, um mikrobielle Kontamination zu vermeiden.
<pclass = "jove_content"> Während dieses Bioreaktorsystem funktioniert gut für Säuger und Insektenzelllinien ist es nicht für Bakterienkulturen entwickelt. Das System kann nicht die schnelle Vermischung und Sauerstoffversorgung, die für die Bakterienzellen erforderlich ist. Bakterielle Wachstum wird am besten in einem Rührkessel-Bioreaktor durchgeführt. Im Vergleich zu anderen Einzel Bioreaktoren für Säugetier oder Insektenzellkultur ist dieses System einfach zu bedienen, bietet ausreichend Daten für die Analyse von Läufen, und hat ähnliche oder bessere Zellwachstum als die anderen Einzelnutzung System das wir geprüft haben.Der Einweg-Bioreaktorsystem pneumatische hat das Potenzial, viele der Forschung und klinische Anwendungen in den Bereichen von Biotherapeutika, Impfstoffe zu treffen, Stammzellen, und personalisierte Medizin 4. Darüber hinaus ist die Flexibilität dieses Systems ermöglicht Batch, Fed-Batch-, Perfusions-und Transfektion bezogen Bioreaktor Anwendungen 5. Schließlich haben Einweg-Bioreaktorsystemen der potenTiAl auf die Bedürfnisse von großen industriellen Produktion gerecht zu werden und um Leitlinien und Empfehlungen der nationalen und internationalen Aufsichtsbehörden 6-10 einzuhalten.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was support in part by Johns Hopkins University, Office of the Provost through the Gateway Science Initiative.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| PBS 3 | PBS | n/a | |
| Single Use Assembly | PBS | n/a | |
| Human Lung Carcinoma Cells (A549) | ATCC | CCL-185 | |
| DMEM High Glucose Medium | |||
| Fetal Bovine Serum | |||
| Trypsin EDTA, 0.25% | |||
| Cytodex 1 Microcarriers | GE | 3781 | |
| Antifoam C | Sigma | A8011 |
References
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