El cultivo de células de mamífero utilizando un solo uso Sistema Neumático biorreactor
Summary
Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.
Abstract
Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor’s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.
Introduction
Líneas de células de mamíferos se pueden clasificar en una de tres categorías basadas en sus características de crecimiento: células que crecen en suspensión, las células que crecen en forma de agregados, y las células que crecen anclado a un sustrato. Aunque el biorreactor de aire de la rueda demostrado en este video es capaz de crecer los tres tipos de células, este video demostrará el uso del biorreactor para cultivar células dependientes de anclaje en micro-soportes. Células de mamíferos dependientes de anclaje pueden ser cultivadas con el propósito de producir más células – donde las propias células son el producto. Por ejemplo, las células madre mesenquimales derivadas de médula ósea humana están siendo cultivadas con el propósito de recoger las células e inyectarlas en el tejido enfermo. El biorreactor neumático demostrado en este vídeo ha demostrado ser adecuado para la producción de dichas células madre mesenquimales para esta aplicación (Serra et al., Comunicación personal, 2013).
Anchorage depcélulas de mamífero se cultivan típicamente endent pequeña escala en recipientes de cultivo 2D tales como placas de cultivo celular, frascos de cultivo de células, o botellas de rodillos, donde se adhieren a una superficie de crecimiento especialmente tratado 1. Cuando se desean más células, las placas o frascos se pueden ampliar mediante el uso de más o grandes vasos. Sin embargo, para un cultivo más rentable de grandes cantidades de células dependientes de anclaje, aumentando el área superficial para la fijación celular que se puede lograr mediante el uso de pequeñas perlas sólidas llamados micro-soportes. Dependiendo de las características de fijación de la célula, diferentes tipos de micro-soportes están disponibles comercialmente, tal como dextrano, un péptido, o colágeno recubierto. Micro-soportes tienen una gran área superficial a volumen que proporciona una mayor superficie para el crecimiento celular; y los micro-soportes se pueden mantener en suspensión con agitación, lo que permite que las células se cultivan a altas densidades en sistemas de biorreactores 2. Actualmente, los tipos de bioreactors donde las células adherentes se cultivan en micro-vehículos incluyen matraces rotativos y sistemas de tanque agitado, que utilizan hélices axiales para mantener la suspensión de las células recubierto micro-soportes.
Varios factores son importantes para el cultivo con éxito de células, incluyendo la tensión de oxígeno, la tensión de cizallamiento, la matriz de superficie, y de nutrientes y las concentraciones de metabolitos. El uso de biorreactores permite la monitorización en tiempo real de las condiciones de crecimiento y el potencial de significativamente más bajos costos de producción 1. Hay varios diseños de biorreactores común para el cultivo in vitro de células incluyendo, suspensión agitada, recipiente de pared giratorio, de fibra hueca, la bolsa de biorreactor en una plataforma de balancín, y sistemas de lecho fluidizado 3. Muchos de estos sistemas presentan problemas únicos para el cultivo de células y la escala -up, tales como el alto costo, los gradientes de concentración de nutrientes, cizallamiento hidrodinámico, la agregación de células, y la dificultad en el muestreo, monitoreo y control de cell de escala.
Varias líneas de células adherentes se utilizan en la producción de virus, ya sea en la producción de vacunas virales o para la producción de vectores virales para aplicaciones de terapia génica. En este video, usando el sencillo uso neumática (aire-ruedas) sistema de biorreactor, se demuestra la cultura de células de carcinoma de pulmón humano (A549) las células en micro-soportes para la producción de un adenovirus oncolítico. El diseño del biorreactor neumática utiliza una rueda de agitación vertical que es alimentado por la flotabilidad del gas burbujeado en la parte inferior del biorreactor. Este método de agitación suave limita las fuerzas de cizallamiento hidrodinámico, pero aún asegura medio y óptima de la célula de mezcla 4. En comparación con el reactor de tanque agitado, el reactor neumático tiene una baja tensión de cizallamiento, incluso con sistemas de biorreactor de aire de la rueda de alto volumen (Figura 1). En contraste con los biorreactores de tanque agitado, el impulsor vertical de este reactor único uso está activado por una corriente de burbujas de gas dentro deel recipiente, lo que permite suave y uniforme de mezcla medio (Figura 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Este sistema de biorreactor de un solo uso es relativamente sencillo de usar y proporciona análisis en tiempo real para la monitorización y el análisis reactor. Está muy bien adecuado para el cultivo de células de mamíferos y de insectos con densidades celulares que llegan a más de 30 millones de células / ml. Además de las células A549 describen en este informe 11, hemos crecido SF-9 células de insectos en el biorreactor también. La mezcla suave proporcionado por la rueda de aire neumático reduce el daño celular. Varios pasos son críticos al establecer este reactor. Primera calibración, apropiado del pH y DO sensores es importante para la vigilancia óptima de la cultura y para la adición de reactivos para ajustar el pH o el oxígeno en el sistema. En segundo lugar, los frascos de reactivos y de semillas deben ser llenados y los accesorios Luer realizan en un ambiente estéril, como un BSC. Una vez que los frascos de reactivos se mueven fuera del ambiente estéril, las conexiones a las líneas de alimentación de biorreactores deben hacerse con cuidado para evitar la contaminación microbiana.
<pclass = "jove_content"> Si bien este sistema de biorreactor funciona bien para las líneas de células de mamíferos e insectos que no está diseñado para los cultivos bacterianos. El sistema no puede proporcionar la mezcla rápida y la oxigenación que se requiere para células bacterianas. El crecimiento bacteriano se realiza mejor en un biorreactor de tanque agitado. En comparación con otros biorreactores de un solo uso para el cultivo de células de mamífero o insecto, este sistema es fácil de usar, proporciona datos suficientes para el análisis de pistas, y tiene el crecimiento celular similar o mejor que el otro sistema de un solo uso que hemos evaluado.El uso único sistema biorreactor neumático tiene el potencial para satisfacer muchas de las investigaciones y aplicaciones clínicas en los campos de bioterapéuticos, vacunas, las células madre y la medicina personalizada 4. Además, la flexibilidad de este sistema permite por lotes, Fed-batch, la perfusión, y las aplicaciones de biorreactores de transfección basado 5. Por último, de un solo uso sistemas de biorreactores desechables tienen el potenciales para satisfacer las necesidades de la producción industrial a gran escala y para cumplir con las directrices y recomendaciones de los organismos reguladores nacionales e internacionales 10.6.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was support in part by Johns Hopkins University, Office of the Provost through the Gateway Science Initiative.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| PBS 3 | PBS | n/a | |
| Single Use Assembly | PBS | n/a | |
| Human Lung Carcinoma Cells (A549) | ATCC | CCL-185 | |
| DMEM High Glucose Medium | |||
| Fetal Bovine Serum | |||
| Trypsin EDTA, 0.25% | |||
| Cytodex 1 Microcarriers | GE | 3781 | |
| Antifoam C | Sigma | A8011 |
References
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