La coltivazione di cellule di mammifero utilizzando un singolo-uso del sistema pneumatico Bioreattore
Summary
Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.
Abstract
Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor’s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.
Introduction
Linee di cellule di mammifero possono essere classificati in una delle tre categorie in base alle loro caratteristiche di crescita: le cellule che crescono in sospensione, le cellule che crescono come aggregati, e le cellule che crescono ancorate ad un substrato. Anche se il bioreattore aria-wheel dimostrato in questo video è in grado di crescere tutti e tre i tipi di cellule, questo video dimostra l'uso del bioreattore a crescere celle dipendenti di ancoraggio sul micro-portanti. Cellule di mammifero dipendenti di ancoraggio possono essere coltivate per lo scopo di produrre più cellule – in cui le cellule stesse sono il prodotto. Ad esempio, osseo derivate cellule staminali mesenchimali osseo umano sono attualmente coltivati con lo scopo di raccolta delle cellule e parenterale in tessuto malato. Il bioreattore pneumatico dimostrato in questo video è dimostrata adatta alla realizzazione di tali cellule staminali mesenchimali per questa applicazione (Serra et al., Comunicazione personale, 2013).
Anchorage depcellule di mammifero Endentski sono tipicamente coltivate su piccola scala in recipienti di coltura 2D come piastre di coltura cellulare, fiasche di coltura cellulare, o bottiglie a rulli, dove aderiscono ad una superficie di crescita specialmente trattata 1. Quando più celle sono desiderati, le piastre o flaconi possono essere espansi utilizzando più o grandi vasi. Tuttavia, per più conveniente coltivazione di grandi quantità di celle dipendenti ancoraggio, aumentando la superficie per l'adesione delle cellule può essere realizzato utilizzando piccole perle solidi chiamati micro-portanti. A seconda delle caratteristiche di fissaggio della cella, diversi tipi di micro-portanti sono disponibili in commercio, come il destrano, peptide, o collagene rivestito. Micro-vettori hanno una grande superficie in rapporto al volume che fornisce una superficie maggiore per la crescita cellulare; e le micro-vettori possono essere mantenuti in sospensione con agitazione, che permette alle cellule di essere coltivati a alta densità nei sistemi di bioreattori 2. Attualmente, i tipi di bioreactors dove cellule aderenti sono coltivate su micro-vettori comprendono fiaschi filatore e sistemi di serbatoi agitati, che utilizzano giranti assiali per mantenere in sospensione le cellule rivestite con micro-portanti.
Diversi fattori sono importanti per la coltivazione di successo di cellule, tra cui tensione di ossigeno, sforzo di taglio, matrici di superficie, e di nutrienti e le concentrazioni del metabolita. L'uso di bioreattori consente il monitoraggio in tempo reale delle condizioni di crescita e il potenziale di costi di produzione notevolmente inferiori 1. Ci sono parecchi disegni bioreattore comune per la coltivazione in vitro di cellule tra cui, sospensione agitata, ruotando vaso a parete, a fibre cave, borsa bioreattore su una piattaforma rocker, e sistemi a letto fluido 3. Molti di questi sistemi presentano problemi particolari per la coltivazione delle cellule e la scala -up, come il costo elevato, gradienti di concentrazione di nutrienti, taglio idrodinamico, l'aggregazione delle cellule, e la difficoltà di campionamento, il monitoraggio, il controllo e cell scale-up.
Varie linee cellulari aderenti sono usati nella produzione di virus, sia nella produzione di vaccini virali o per la produzione di vettori virali per applicazioni in terapia genica. In questo video, utilizzando l'unico uso pneumatico sistema di bioreattore (Air-Wheel), dimostriamo la coltura delle cellule di carcinoma polmonare umano (A549), le cellule di micro-vettori per la produzione di un adenovirus oncolitici. Il disegno bioreattore pneumatico utilizza una ruota agitazione verticale che è alimentato dalla galleggiabilità di gas strippata nel fondo del bioreattore. Questo metodo agitazione delicato limita le forze di taglio idrodinamiche, ma assicura comunque di medie e cellulare ottimale miscelazione 4. Rispetto al reattore serbatoio agitato, il reattore pneumatico ha una bassa sforzi di taglio anche con sistemi di bioreattori Air-Wheel grande disponibilità (Figura 1). In contrasto bioreattori agitati cisterna, la girante verticale di questo unico reattore uso è attivata da un flusso di bolle di gas all'internoil vaso, che consente delicata ed uniforme miscelazione medio (Figura 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo sistema di bioreattore monouso è relativamente semplice da usare e fornisce analisi in tempo reale per il monitoraggio e l'analisi del reattore. E 'estremamente adatto per la coltura di cellule di mammiferi e insetti con densità di cellule che raggiungono oltre 30 milioni di cellule / ml. Oltre cellule A549 descritti in questo rapporto 11, siamo cresciuti SF-9 cellule di insetto nel bioreattore pure. La miscelazione delicata fornito dalla ruota di aria pneumatica riduce il danno cellulare. Diversi passaggi sono fondamentali quando si imposta questo reattore. In primo luogo, la corretta calibrazione del pH e DO sensori è importante per il controllo ottimale della coltura e per l'aggiunta di reagenti per regolare il pH o l'ossigeno nel sistema. In secondo luogo, i flaconi dei reagenti e sementi devono essere riempiti e gli attacchi luer effettuate in ambiente sterile come una BSC. Una volta che i flaconi dei reagenti vengono spostati fuori dell'ambiente sterile, i collegamenti con le linee di alimentazione bioreattore devono essere fatte con cura per evitare la contaminazione microbica.
<pclass = "jove_content"> Anche se questo sistema di bioreattore funziona bene per le linee cellulari di mammiferi e insetti non è progettato per colture batteriche. Il sistema non può fornire la miscelazione rapida e ossigenazione che è necessario per le cellule batteriche. La crescita batterica è meglio realizzato in un bioreattore serbatoio agitato. Rispetto ad altri bioreattori monouso per colture cellulari di mammifero o di insetto, questo sistema è facile da usare, fornisce dati sufficienti per l'analisi di piste, e ha una crescita cellulare simile o migliore rispetto agli altri sistemi monouso abbiamo valutato.Il sistema di bioreattore pneumatico uso singola ha il potenziale per soddisfare molte delle attività di ricerca e applicazioni cliniche nel campo delle bioterapie, vaccini, cellule staminali e medicina personalizzata 4. Inoltre, la flessibilità di questo sistema permette di batch, fed-batch, perfusione, e le applicazioni bioreattore trasfezione basate 5. Infine, i sistemi di bioreattori monouso monouso hanno il potenziale per soddisfare le esigenze di larga scala la produzione industriale e di aderire alle linee guida e raccomandazioni di agenzie di regolamentazione nazionali e internazionali 6-10.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was support in part by Johns Hopkins University, Office of the Provost through the Gateway Science Initiative.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| PBS 3 | PBS | n/a | |
| Single Use Assembly | PBS | n/a | |
| Human Lung Carcinoma Cells (A549) | ATCC | CCL-185 | |
| DMEM High Glucose Medium | |||
| Fetal Bovine Serum | |||
| Trypsin EDTA, 0.25% | |||
| Cytodex 1 Microcarriers | GE | 3781 | |
| Antifoam C | Sigma | A8011 |
References
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