טיפוח של תאי יונקים באמצעות מערכת פניאומטיים Bioreactor יחיד שימוש
Summary
Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.
Abstract
Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor’s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.
Introduction
ניתן לסווג קווי תאי יונקים לאחת משלוש קטגוריות המבוססות על המאפיינים שלהם צמיחה: תאים שגדלים בהשעיה, תאים שגדלים כאגרגטים, ותאים שגדלים מעוגן למצע. למרות bioreactor אוויר הגלגל הפגין בסרט הזה הוא מסוגל לגדול כל שלושת סוגים של תאים, בסרטון זה ידגים שימוש בbioreactor לגדל תאים תלויים מעגן במייקרו ספקים. תאי יונקים תלויים Anchorage ניתן לגדל לצורך הפקת תאים נוספים – שבו התאים עצמם הם התוצר. לדוגמא, תאי גזע mesenchymal מח עצם נגזר אנושי נמצאים בשלבים טיפחו במטרה לקצור את התאים והזרקה אותם לרקמה חולה. Bioreactor פנאומטי הפגין בסרט הזה הוכיח מתאים לייצור תאי גזע mesenchymal כזה עבור יישום זה (Serra et al., תקשורת אישית, 2013).
dep Anchorageתאי יונקים endent בדרך כלל גדלים בקנה מידה קטנה בכלי תרבות 2D כגון צלחות תרבית תאים, צלוחיות תרבית תאים, או בקבוקי רולר, שבו הם לדבוק משטח צמיחת טיפול מיוחד 1. כאשר יותר תאים רצויים, ניתן להרחיב את הצלחות או צלוחיות באמצעות יותר או גדולים יותר כלים. עם זאת, לגידול חסכוני יותר של כמויות גדולות של תאים תלויים מעגן, הגדלת שטח הפנים להתקשרות סלולארי ניתן להשיג על ידי שימוש בחרוזים מוצקים קטנים בשם מיקרו ספקים. בהתאם למאפייני ההתקשרות של התא, כמה סוגים שונים של מיקרו-נשאים זמינים מסחרי, כגון dextran, פפטיד, או קולגן מצופה. יש לי מייקר נשאים שטח פנים גדול יחס נפח מתן שטח פנים גדול יותר לצמיחת תאים; ויכולים להישמר מיקרו ספקים בהשעיה עם תסיסה, המאפשרת לתאים להיות מעובדות לצפיפויות גבוהות במערכות bioreactor 2. נכון לעכשיו, את סוגי bioreactors בי תאים חסיד גדלים על מיקרו-נשאים כוללים צלוחיות טווה ומערכות טנק עוררו, אשר משתמשות במדחפים צירי כדי לשמור על השעיה של מיקרו-נשאי התא מצופה.
מספר גורמים חשובים לגידול המוצלח של תאים כולל מתח חמצן, מאמץ גזירה, מטריצת פני השטח, ומזין וריכוזי המטבוליט. השימוש בbioreactors מאפשר ניטור בזמן אמת של תנאי גידול ואת הפוטנציאל לעלויות ייצור נמוך באופן משמעותי 1. ישנם מספר עיצובי bioreactor הנפוץ לגידול במבחנה תא כולל, השעיה עוררה, קיר כלי מסתובב, חלולים סיבים, bioreactor תיק על פלטפורמת נדנדה, ומערכות מיטה מרחפות 3. רבות ממערכות אלה להציג את הבעיות ייחודיות לטיפוח תא ואת קנה המידה -up, כגון עלות גבוהה, שיפועי ריכוז חומרי תזונה, גזירה הידרודינמית, צבירת תא, וקושי בדגימה, ניטור, וcel שליטהבהיקף של עד ליטר.
שורות תאים חסיד שונות המשמשות בייצור של וירוסים, או בייצור של חיסונים נגיפיים או לייצור של וקטורים ויראליים ליישומי ריפוי גנטי. בסרטון הזה, באמצעות פנאומטי ליחד המערכת (Air-Wheel) bioreactor, אנחנו מדגימים את התרבות של תאים אנושיים קרצינומה של ריאה (A549) תאים על מיקרו-נשאים לייצור של אדנווירוס oncolytic. עיצוב bioreactor פנאומטי משתמש בגלגל תסיסה אנכי המופעל על ידי כוח העילוי של גז sparged לתוך החלק התחתון של bioreactor. שיטת ערבוב עדינה זה מגבילה כוחות גזירה הידרודינמית, אבל עדיין מבטיחה בינוני ותא אופטימליים ערבוב 4. בהשוואה לכור הטנק עורר, יש כור פנאומטי מתח קיר גזירה נמוך אפילו עם מערכות בנפח גבוה bioreactor Air-הגלגל (איור 1). בניגוד לbioreactors טנק עורר, המאיץ האנכי של כור ליחד זו מופעל על ידי זרם של בועות גז בתוךהכלי, המאפשר לערבוב עדין ואחיד בינוני (איור 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
מערכת bioreactor שימוש יחיד זה היא יחסית פשוטה לשימוש ומספקת ניתוח בזמן אמת לניטור כור וניתוח. הוא מאוד מתאים גם לתרבית תאים של יונקים וחרקים עם צפיפות תאים מגיעה ליותר מ 30 מיליון תאים / מ"ל. חוץ תאי A549 מתוארים בדוח זה 11, יש לנו גדלתי SF-9 תאי חרקים בbioreactor גם כן. הערבוב העדין הניתן על ידי גלגל אוויר פנאומטי מפחית נזק לתאים. כמה צעדים הם קריטיים בעת הגדרת כור זה. הכיול הראשון, נכון של pH ולעשות חיישנים חשוב לניטור אופטימלי של התרבות ולתוספת של חומרים כימיים כדי להתאים את pH או החמצן במערכת. שנית, הבקבוקים מגיב וזרע חייבים להיות מלאים ואת הקבצים המצורפים luer שנעשו בסביבת סטרילית, כגון BSC. ברגע שהבקבוקים מגיב מועברים אל מחוץ לסביבת סטרילית, החיבורים לקווי הזנת bioreactor חייבים להיעשות בזהירות כדי למנוע זיהום מיקרוביאלי.
<pclass = "jove_content"> בעוד מערכת bioreactor זה עובדת היטב עבור שורות תאי יונקים וחרקים זה אינו מיועד לתרבויות חיידקים. המערכת אינה יכולה לספק את הערבוב המהיר וחמצון שנדרש לתאי חיידקים. התפתחות חיידקים נעשה הכי טובה בbioreactor טנק עורר. בהשוואה לbioreactors ליחד אחר לתרבית תאי יונקים או חרקים, מערכת זו היא קלה לשימוש, מספקת נתונים מספיקים לניתוח של ריצות, ויש צמיחת תאים דומה או טובה יותר מהמערכת לשימוש חד אחרת שהערכנו.מערכת bioreactor פנאומטי ליחד יש פוטנציאל לפגוש רב של המחקר ויישומים קליניים בתחומי יות'רפיוטיקס, חיסונים, תאי גזע, ורפואה אישית 4. בנוסף, הגמישות של מערכת זו מאפשרת לתצווי, Fed-אצווה, זלוף, ויישומי bioreactor Transfection מבוסס 5. לבסוף, יש לי מערכות bioreactor חד פעמיות לשימוש חד פעמי אין הסופיותTial כדי לענות על הצרכים של ייצור תעשייתי בקנה מידה גדולה ולדבוק בהנחיות והמלצות של גופי רגולטורים לאומיים ובינלאומיים 6-10.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was support in part by Johns Hopkins University, Office of the Provost through the Gateway Science Initiative.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| PBS 3 | PBS | n/a | |
| Single Use Assembly | PBS | n/a | |
| Human Lung Carcinoma Cells (A549) | ATCC | CCL-185 | |
| DMEM High Glucose Medium | |||
| Fetal Bovine Serum | |||
| Trypsin EDTA, 0.25% | |||
| Cytodex 1 Microcarriers | GE | 3781 | |
| Antifoam C | Sigma | A8011 |
References
- Freshney, R. I. . Culture of Animal Cells A Manual of Basic Techniques and Specialized Applications. , (2010).
- Healthcare, G. E. Microcarrier Cell Culture Principles and Methods. GE Healthcare Data File 18-1140-62. , (2005).
- Simaria, A. S., et al. Allogeneic cell therapy bioprocess economics and optimization Single-Use cell expansion Technologies. Biotechnol and Bioeng. 111 (1), 69-83 (2014).
- Lee, B., Fang, D., Croughan, M., Carrondo, M., Paik, S. -. H. Characterization of novel pneumatic mixing for single-use bioreactor application. BMC Proc. 5 (S8), O12 (2011).
- Eibl, R., Eibl, D. Disposable bioreactors in cell culture-based upstream processing. BioProcess Int. 7 (S1), 18-23 (2009).
- Chaubard, J. F., et al. Disposable bioreactors for viral vaccine production challenges and opportunities. Biopharm Int Supp. , (2010).
- Croughan, M. S., Hamel, J. F., Wang, D. I. C. Hydrodynamic Effects on Animal Cells Grown in Microcarrier Cultures. Biotechnol and Bioeng. 95 (2), 295-305 (2006).
- DePalma, A. Single-use Equipment on Cusp of Industrialization. Genet Eng Biotechnol News. 32 (1), (2012).
- Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. . Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. , (2010).
- Sousa, M. F., Giroux, D., Clemente, J., Lee, B., Carrondo, M. J., Alves, P. M. . Impact of Bioreactor Design on the Performance of Microcarrier Cultures. , (2012).
