La culture de cellules de mammifères en utilisant un système pneumatique bioréacteur à usage unique
Summary
Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.
Abstract
Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor’s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.
Introduction
Lignées de cellules de mammifères peuvent être classés en trois catégories en fonction de leurs caractéristiques de croissance: les cellules qui se développent en suspension, les cellules qui poussent comme des agrégats, et les cellules qui poussent ancré sur un substrat. Bien que le bioréacteur air roues démontré dans cette vidéo est capable de croître tous les trois types de cellules, cette vidéo démontre l'utilisation du bioréacteur à cultiver des cellules dépendantes de l'ancrage sur les micro-supports. Des cellules de mammifère dépendantes d'un support peuvent être cultivées dans le but de produire plusieurs cellules – où les cellules elles-mêmes sont le produit. Par exemple, les cellules souches mésenchymateuses dérivées de moelle osseuse humaine sont actuellement cultivés dans le but de récolter les cellules et de les injecter dans le tissu malade. Le bioréacteur pneumatique montré dans cette vidéo s'est avéré approprié pour la production de ces cellules souches mésenchymateuses de la présente demande (Serra et al., Communication personnelle, 2013).
Anchorage deples cellules de mammifères sont généralement de endent cultivées à petite échelle dans des récipients de culture 2D tels que des plaques de culture cellulaire, des flacons de culture cellulaire, ou des bouteilles roulantes, où elles adhèrent à une surface de croissance spécialement traité 1. Lorsque plusieurs cellules sont souhaitées, les plaques ou les flacons peuvent être développées en utilisant des navires de plus ou plus. Cependant, pour plus de culture rentable de grandes quantités de cellules dépendantes de l'ancrage, ce qui augmente la surface pour la fixation des cellules peut être réalisée en utilisant de petites billes solides appelées micro-supports. En fonction des caractéristiques de fixation de la cellule, plusieurs types différents de micro-supports sont disponibles dans le commerce, tels que le dextrane, un peptide, ou revêtues de collagène. Les micro-porteurs ont une grande surface par rapport au volume offrant une plus grande surface pour la croissance des cellules; et les micro-supports peuvent être maintenues en suspension par agitation, ce qui permet aux cellules d'être cultivées à des densités élevées en deux systèmes de bioréacteurs. Actuellement, les types de bioreacteurs où les cellules adhérentes sont cultivées sur des micro-supports comprennent des flacons spinner et des systèmes de réservoir agité, qui utilisent des turbines axiales à maintenir une suspension de enrobées de cellules micro-transporteurs.
Plusieurs facteurs sont importants pour le succès de la culture de cellules, y compris la tension en oxygène, la contrainte de cisaillement, la surface de la matrice, et les concentrations d'éléments nutritifs et de métabolites. L'utilisation de bioréacteurs permet la surveillance en temps réel des conditions de croissance et le potentiel de façon significative les coûts de production inférieurs 1. Il existe plusieurs modèles de bioréacteurs commun pour la culture in vitro de cellules, y compris, suspension agitée, tournant navire de mur, à fibres creuses, sac bioréacteur sur une plate-forme de bascule, et les systèmes à lit fluidisé 3. Beaucoup de ces systèmes présentent des problèmes particuliers pour la culture de cellules et de l'échelle -up, tels que le coût élevé, des éléments nutritifs des gradients de concentration, de cisaillement hydrodynamique, l'agrégation de cellules, et la difficulté de l'échantillonnage, la surveillance et le contrôle de cell échelle.
Diverses lignées de cellules adhérentes sont utilisés dans la production de virus, que ce soit dans la production de vaccins viraux ou pour la production de vecteurs viraux pour des applications de thérapie génique. Dans cette vidéo, à l'aide de l'utilisation unique pneumatique (air-roue) système de bioréacteur, nous démontrons la culture de cellules de carcinome de poumon humain (A549) de cellules sur micro-supports pour la production d'un adénovirus oncolytique. La conception du bioréacteur pneumatique utilise une roue à agitation verticale qui est alimenté par la flottabilité du gaz injecté dans la partie inférieure du bioréacteur. Cette méthode d'agitation douce limite des forces de cisaillement hydrodynamiques, mais assure toujours moyen optimal et cellule de mélange 4. Par rapport au réacteur à cuve agitée, le réacteur pneumatique a une faible contrainte de cisaillement de paroi, même avec des systèmes de bioréacteurs Air-roue en grand volume (figure 1). Contrairement aux bioréacteurs à cuve agitée, la roue verticale de ce réacteur à usage unique est activé par un courant de bulles de gaz à l'intérieurle récipient, ce qui permet de tendre et uniforme moyen mélangeur (figure 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce système de bioréacteur à usage unique est relativement simple à utiliser et fournit des analyses en temps réel pour la surveillance et l'analyse réacteur. Il est très bien adapté pour la culture de cellules de mammifères et d'insectes avec des densités cellulaires atteignant plus de 30 millions de cellules / ml. Outre les cellules A549 décrits dans ce rapport 11, nous avons grandi SF-9 cellules d'insectes dans le bioréacteur ainsi. Le mélange doux fourni par la roue d'air pneumatique réduit les dommages cellulaires. Plusieurs étapes sont essentielles lors de la création de ce réacteur. Tout d'abord, le calibrage approprié du pH et les sondes à oxygène sont importantes pour le contrôle optimal de la culture et pour l'addition de réactifs pour ajuster le pH ou l'oxygène dans le système. Deuxièmement, les flacons de réactifs et de semences doivent être remplis et les pièces jointes luer fait dans un environnement stérile comme un BSC. Une fois que les bouteilles de réactif sont déplacés hors de l'environnement stérile, les liaisons avec les lignes d'alimentation de bioréacteur doivent être effectués avec soin pour éviter une contamination microbienne.
<pclass = "jove_content"> Bien que ce système de bioréacteur fonctionne bien pour les lignes cellulaires mammifères et d'insectes, il n'est pas conçu pour des cultures bactériennes. Le système ne peut pas fournir le mélange rapide et l'oxygénation qui est nécessaire pour les cellules bactériennes. La croissance bactérienne est mieux assurée dans un bioréacteur à cuve agitée. Par rapport à d'autres bioréacteurs à usage unique pour la culture de cellules de mammifères ou d'insectes, ce système est facile à utiliser, fournit des données suffisantes pour l'analyse des pistes, et a la croissance des cellules similaire ou meilleure que l'autre système à usage unique que nous avons évalué.Le système de bioréacteur pneumatique à usage unique a le potentiel de répondre à un grand nombre de la recherche et les applications cliniques dans les domaines de produits biothérapeutiques, les vaccins, les cellules souches et la médecine personnalisée 4. En outre, la souplesse de ce système permet de batch, fed-batch, la perfusion, et la transfection à base de bioréacteur applications 5. Enfin, à usage unique systèmes de bioréacteurs jetables ont le potentiel pour répondre aux besoins de la production industrielle à grande échelle et à se conformer aux directives et recommandations des organismes de réglementation nationaux et internationaux 6-10.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was support in part by Johns Hopkins University, Office of the Provost through the Gateway Science Initiative.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| PBS 3 | PBS | n/a | |
| Single Use Assembly | PBS | n/a | |
| Human Lung Carcinoma Cells (A549) | ATCC | CCL-185 | |
| DMEM High Glucose Medium | |||
| Fetal Bovine Serum | |||
| Trypsin EDTA, 0.25% | |||
| Cytodex 1 Microcarriers | GE | 3781 | |
| Antifoam C | Sigma | A8011 |
References
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