培养哺乳动物细胞使用一次性使用气动生物反应器系统
Summary
Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.
Abstract
Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor’s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.
Introduction
哺乳动物细胞系，可分为基于它们的生长特性三类：细胞生长于悬浮液中的细胞生长为聚集体，以及细胞生长锚定到基底。虽然空气轮生物反应器中的该视频演示是能够生长的所有三种类型的细胞，该视频将演示用的生物反应器中生长贴壁依赖性细胞的微载体。锚地依赖性哺乳动物细胞能够生长的制造多细胞的目的 – 在细胞本身的产品。例如，人骨髓间充质干细胞，目前正在栽培的收获细胞，并注射到病变组织的目的。在此视频演示的气动生物反应器已被证明适用于生产诸如间充质干细胞的这种应用（塞拉等人 ，个人通信，2013）。
安克雷奇出发endent哺乳动物细胞通常生长小规模在2D培养容器中，如细 胞培养板中，细胞培养瓶或滚瓶中，在那里它们粘附在经特殊处理的生长面1。当更多的单元被需要，该板或培养瓶可通过使用更多或更大的船只进行扩展。然而，对于更符合成本效益的栽培大量贴壁依赖性细胞，增加表面积为细胞附着可以通过使用小的固体颗粒称为微载体来实现。根据细胞的附着特性，有几种不同类型的微载体可商购的，如葡聚糖，肽或胶原包衣。微载体具有大的表面积与体积之比提供了更大的表面积用于细胞生长;和微载体可以保持在悬浮液中并搅拌，从而使这些细胞进行培养，以高密度，在生物反应器系统2。 biorea目前，该类型的其中贴壁细胞生长在微载体构建函数包括旋转烧瓶中，搅拌罐系统，其使用轴向叶轮保持悬浮液中的细胞涂布的微载体。
几种因素是很重要的成功培养细胞，包括氧张力，剪切应力，表面基质，和营养物和代谢物的浓度。利用生物反应器的允许生长的条件的实时监测和潜力显著降低生产成本1。有几个共同的生物反应器设计用于体外细胞培养，包括搅拌，旋转壁容器中，中空纤维，在摇杆平台袋生物反应器和流化床系统3。许多这些系统目前唯一的问题进行细胞培养和规模-up，如成本高，营养浓度梯度，流体剪切，细胞聚集，以及难以取样，监测和控制CEL升扩大规模。
各种粘附细胞系被用于生产病毒，要么在生产病毒疫苗或用于生产病毒载体用于基因治疗的应用。在这段视频中，采用一次性使用的气动（空气轮）生物反应器系统，我们证明人类肺癌细胞（A549）细胞在微载体生产的溶瘤腺病毒的培养。的气动生物反应器设计使用由气体喷入到反应器底部的浮力驱动的垂直搅拌轮。这种温和的搅拌方法限制流体剪切力，但仍保证了最佳培养基和细胞混合4。相比于搅拌槽反应器，该气动反应器具有低的壁剪切应力，即使以高音量气轮的生物反应器系统（ 图1）。而相比之下，搅拌罐生物反应器，该单次使用的反应器的垂直叶轮由气泡内的流导容器，其允许平缓而均匀的介质中的混合（ 图2）。
Protocol
Representative Results
Discussion
这种一次性使用的生物反应器系统是相对简单的使用，并提供实时分析的反应器监测和分析。这是非常适合以及哺乳动物和昆虫细胞培养与细胞密度达到30多万个细胞/ ml。除了A549细胞这个报告11中所述，我们已经发展SF-9昆虫细胞在生物反应器为好。由气动轮设置在温和混合减少细胞损伤。建立这个反应器时，有几个步骤是至关重要的。 pH值的第一，适当的校准和DO传感器是用于培养的最佳监测和加入试剂以调节pH或氧在该系统的重要。第二，试剂和种子的瓶子必须填写与鲁尔装在无菌的环境中进行，例如BSC。一旦试剂瓶被移出无菌环境中，连接到所述生物反应器进料管线必须作出谨慎，以避免微生物的污染。
<pCLASS =“jove_content”>虽然这种生物反应器系统，非常适用于哺乳动物和昆虫细胞系是不适合细菌培养。系统不能提供所需的细菌细胞的快速混合和充氧。细菌生长的最好实现在搅拌式生物反应器。相比于其他一次性使用的生物反应器用于哺乳动物或昆虫细胞培养，此系统很容易使用，提供了足够的数据，运行的分析，且具有相似或更好的细胞生长比我们评估的其他一次性使用的系统。单次使用的气动生物反应器系统有潜力满足众多的研究和生物治疗，疫苗等领域的临床应用中，干细胞，和个性化药物4。此外，该系统的灵活性，允许分批，补料，灌注，并根据转染生物反应器的应用5。最后，单次使用的一次性生物反应器系统具有POTENTiAl基合金，以满足大规模工业生产的需要，并坚持的指导方针以及国家和国际监管机构6-10建议。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was support in part by Johns Hopkins University, Office of the Provost through the Gateway Science Initiative.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| PBS 3 | PBS | n/a | |
| Single Use Assembly | PBS | n/a | |
| Human Lung Carcinoma Cells (A549) | ATCC | CCL-185 | |
| DMEM High Glucose Medium | |||
| Fetal Bovine Serum | |||
| Trypsin EDTA, 0.25% | |||
| Cytodex 1 Microcarriers | GE | 3781 | |
| Antifoam C | Sigma | A8011 |
References
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