زراعة خلايا الثدييات عن طريق استخدام المفرد نظام هوائي تفاعلات الاحيائية
Summary
Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.
Abstract
Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor’s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.
Introduction
خطوط خلايا الثدييات يمكن تصنيفها إلى واحدة من ثلاث فئات على أساس الخصائص نموها: الخلايا التي تنمو في التعليق، والخلايا التي تنمو المجاميع والخلايا التي تنمو ترتكز على هذه الركيزة. على الرغم من أن مفاعل حيوي عجلة الهواء موضح في هذا الفيديو هو قادرة على النمو عن ثلاثة أنواع من الخلايا، وهذا الفيديو يظهر استخدام مفاعل حيوي لزراعة الخلايا التابعة مرسى على حاملات الدقيقة. يمكن زراعة خلايا الثدييات تعتمد مرسى لغرض إنتاج المزيد من الخلايا – حيث الخلايا نفسها هي نتاج. على سبيل المثال، يجري حاليا زراعة نخاع المستمدة الخلايا الجذعية الوسيطة العظم البشري بغرض حصاد الخلايا وحقنها داخل الأنسجة المريضة. وقد ثبت مفاعل حيوي هوائي موضح في هذا الفيديو مناسبة لإنتاج مثل هذه الخلايا الجذعية الوسيطة لهذا التطبيق (سيرا آخرون، اتصال شخصي 2013).
مرسى إقلاعوعادة ما تزرع خلايا الثدييات endent نطاق صغير في الأوعية ثقافة 2D مثل لوحات ثقافة الخلية، قوارير زراعة الخلايا، أو زجاجات الأسطوانة، حيث تلتزم سطح النمو معاملة خاصة 1. عندما يتم المطلوب المزيد من الخلايا، لوحات أو قوارير يمكن توسيعها باستخدام أكثر أو أكبر السفن. ومع ذلك، لزراعة فعالة من حيث التكلفة أكثر من كميات كبيرة من الخلايا التابعة مرسى، زيادة مساحة السطح لمرفق الخلية ويمكن تحقيق ذلك باستخدام حبات صلبة صغيرة تسمى الناقلات الصغيرة. اعتمادا على خصائص مرفق الخلية، عدة أنواع مختلفة من الناقلات الصغيرة متوفرة تجاريا، مثل ديكستران، الببتيد، أو الكولاجين المغلفة. حاملات الصغيرة لديها مساحة كبيرة لنسبة حجم توفير مساحة أكبر لنمو الخلايا. وشركات الطيران الصغيرة يمكن الحفاظ في تعليق مع الانفعالات، مما يسمح للخلايا لزراعتها إلى كثافة عالية في أنظمة مفاعل حيوي 2. حاليا، وأنواع bioreactors حيث تزرع الخلايا الملتصقة على حاملات القوارير الصغيرة تشمل الدوار والنظم خزان أثار، والتي تستخدم الضواغط المحورية للحفاظ على تعليق الخلية المغلفة شركات الصغيرة.
عدة عوامل مهمة لنجاح زراعة الخلايا بما في ذلك التوتر الأكسجين، وإجهاد القص، مصفوفة السطح، والمواد الغذائية وتركيزات المستقلب. استخدام المفاعلات الحيوية يسمح للرصد في الوقت الحقيقي من ظروف النمو والقدرة على أقل بكثير من تكاليف الإنتاج 1. هناك العديد من التصاميم مفاعل حيوي مشترك لزراعة الخلايا في المختبر بما في ذلك، أثار تعليق، سفينة الدورية جدار، أجوف الألياف، حقيبة مفاعل حيوي على منصة الروك، وأنظمة قاعدة مميعة 3. العديد من هذه الأنظمة يمثل مشكلة فريدة من نوعها لزراعة الخلايا وتوسيع نطاق -حتى، مثل التكلفة العالية والتدرجات تركيز المغذيات، والقص الهيدروديناميكية، تجميع الخلايا، وصعوبة في أخذ العينات والرصد والسيطرة على سلل نطاق المتابعة.
وتستخدم العديد من خطوط الخلايا الملتصقة في إنتاج الفيروسات، سواء في إنتاج اللقاحات الفيروسية أو لإنتاج النواقل الفيروسية لتطبيقات العلاج الجيني. في هذا الفيديو، وذلك باستخدام استخدام هوائي واحد (الهواء بعجل) نظام مفاعل حيوي، ونحن لشرح ثقافة خلايا سرطان الرئة الإنسان (A549) الخلايا على ناقلات الدقيقة لإنتاج اتش حال الورم. تصميم مفاعل حيوي يستخدم هوائي عجلة التحريض العمودي الذي هو مدعوم من قبل الطفو من الغاز sparged في الجزء السفلي من مفاعل حيوي. يحد هذا الأسلوب التحريك لطيف قوى القص الهيدروديناميكية، ولكن لا يزال يضمن المتوسطة الأمثل وخلية خلط 4. بالمقارنة مع مفاعل أثار خزان، المفاعل هوائي لديه منخفضة التوتر جدار القص حتى مع أنظمة مفاعل حيوي الهواء عجلة كبيرة الحجم (الشكل 1). على النقيض من المفاعلات الحيوية خزان أثار، يتم تشغيل المكره العمودي هذا المفاعل استخدام مرة واحدة من قبل تيار من فقاعات الغاز داخلالسفينة، والذي يسمح لطيف وموحدة خلط المتوسطة (الشكل 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا النظام مفاعل حيوي تستخدم مرة واحدة بسيطة نسبيا للاستخدام، ويقدم تحليلات في الوقت الحقيقي لرصد وتحليل المفاعل. وتناسب بشكل جيد للغاية للثقافة خلايا الثدييات والحشرات ذات الكثافة خلية تصل إلى أكثر من 30 مليون خلية / مل. بالإضافة إلى خلايا A549 وصفت في هذا التقرير 11، لقد نمت SF-9 خلايا الحشرات في مفاعل حيوي أيضا. اختلاط اللطيف تقدمها عجلة الهواء الهوائية يقلل من تلف الخلايا. عدة خطوات حاسمة عند إعداد هذا المفاعل. الأولى، معايرة درجة الحموضة والقيام مجسات مهمة لرصد الأمثل للثقافة وإضافة الكواشف لضبط درجة الحموضة أو الأكسجين في النظام. ثانيا، يجب أن تملأ الكاشف والبذور الزجاجات والمرفقات بالتركيبة المحرز في بيئة معقمة مثل BSC. مرة واحدة يتم نقل الزجاجات كاشف للخروج من بيئة معقمة، يجب أن يتم على الاتصالات إلى خطوط تغذية مفاعل حيوي مع الحرص على تجنب التلوث الميكروبي.
<pالطبقة = "jove_content"> ورغم أن هذا النظام مفاعل حيوي يعمل بشكل جيد لخطوط خلايا الثدييات والحشرات ليست مصممة لأنها الثقافات البكتيرية. لا يمكن للنظام توفير خلط السريع والأوكسجين اللازم للخلايا البكتيرية. هو أفضل إنجاز نمو البكتيريا في خزان مفاعل حيوي أثار. بالمقارنة مع غيرها من المفاعلات الحيوية تستخدم مرة واحدة لزراعة الخلايا الثديية أو الحشرات، وهذا النظام سهل الاستخدام، يوفر بيانات كافية لتحليل أشواط، والنمو خلية مماثلة أو أفضل من استخدام نظام واحد آخر لدينا تقييم.استخدام نظام مفاعل حيوي هوائي واحد لديه القدرة على تلبية العديد من البحوث والتطبيقات السريرية في مجالات biotherapeutics، واللقاحات، والخلايا الجذعية، والطب الشخصي 4. بالإضافة إلى ذلك، مرونة هذا النظام يسمح للدفعة، بنك الاحتياطي الفيدرالي دفعة، الإرواء، وترنسفكأيشن التطبيقات القائمة على مفاعل حيوي 5. أخيرا، تستخدم مرة واحدة أنظمة مفاعل حيوي المتاح لديها الهياجللمحاكمة لتلبية احتياجات الإنتاج الصناعي على نطاق واسع والتمسك مبادئ توجيهية وتوصيات الهيئات التنظيمية الوطنية والدولية 6-10.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was support in part by Johns Hopkins University, Office of the Provost through the Gateway Science Initiative.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| PBS 3 | PBS | n/a | |
| Single Use Assembly | PBS | n/a | |
| Human Lung Carcinoma Cells (A549) | ATCC | CCL-185 | |
| DMEM High Glucose Medium | |||
| Fetal Bovine Serum | |||
| Trypsin EDTA, 0.25% | |||
| Cytodex 1 Microcarriers | GE | 3781 | |
| Antifoam C | Sigma | A8011 |
References
- Freshney, R. I. . Culture of Animal Cells A Manual of Basic Techniques and Specialized Applications. , (2010).
- Healthcare, G. E. Microcarrier Cell Culture Principles and Methods. GE Healthcare Data File 18-1140-62. , (2005).
- Simaria, A. S., et al. Allogeneic cell therapy bioprocess economics and optimization Single-Use cell expansion Technologies. Biotechnol and Bioeng. 111 (1), 69-83 (2014).
- Lee, B., Fang, D., Croughan, M., Carrondo, M., Paik, S. -. H. Characterization of novel pneumatic mixing for single-use bioreactor application. BMC Proc. 5 (S8), O12 (2011).
- Eibl, R., Eibl, D. Disposable bioreactors in cell culture-based upstream processing. BioProcess Int. 7 (S1), 18-23 (2009).
- Chaubard, J. F., et al. Disposable bioreactors for viral vaccine production challenges and opportunities. Biopharm Int Supp. , (2010).
- Croughan, M. S., Hamel, J. F., Wang, D. I. C. Hydrodynamic Effects on Animal Cells Grown in Microcarrier Cultures. Biotechnol and Bioeng. 95 (2), 295-305 (2006).
- DePalma, A. Single-use Equipment on Cusp of Industrialization. Genet Eng Biotechnol News. 32 (1), (2012).
- Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. . Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. , (2010).
- Sousa, M. F., Giroux, D., Clemente, J., Lee, B., Carrondo, M. J., Alves, P. M. . Impact of Bioreactor Design on the Performance of Microcarrier Cultures. , (2012).
