Módulo de iluminación solo plano y Aproximación Micro-capilar para un microscopio de campo amplio
Summary
Un módulo para la iluminación microscopía de plano único (SPIM) se describe que se adapta fácilmente a un microscopio de campo amplio invertida y optimizado para cultivos celulares 3-dimensionales. La muestra se encuentra dentro de un capilar rectangular, y a través de un sistema de microfluidos colorantes fluorescentes, agentes farmacéuticos o medicamentos puede ser aplicado en pequeñas cantidades.
Abstract
Un módulo para la hoja de luz o iluminación microscopía de plano único (SPIM) se describe que se adapta fácilmente a un microscopio de campo amplio invertida y optimizado para cultivos de células de 3 dimensiones, por ejemplo, esferoides tumorales multicelulares (MCT). Las formas del módulo de excitación SPIM y desvía la luz de tal manera que la muestra es iluminada por una lámina de luz perpendicular a la trayectoria de detección del microscopio. El sistema se caracteriza por el uso de un capilar rectangular para sostener (y en una versión avanzada también por un enfoque de micro capilar para hacer girar) las muestras, mediante el ajuste sincrónico de la hoja de luz de iluminación y la lente del objetivo utilizada para la detección de fluorescencia, así como por la adaptación de un sistema de microfluidos para la aplicación de tintes fluorescentes, agentes farmacéuticos o medicamentos en pequeñas cantidades. Se da un protocolo para trabajar con este sistema, y algunos detalles técnicos son reportados. Los resultados representativos incluyen (1) mediciones de la UPtomar de un fármaco citostático (doxorrubicina) y su conversión parcial a un producto de degradación, (2) mediciones redox mediante el uso de un sensor de glutatión codificado genéticamente después de la adición de un agente oxidante, y (3) la iniciación y el etiquetado de necrosis celular de la inhibición de la cadena respiratoria mitocondrial. Se discuten las diferencias y ventajas de la presente módulo SPIM en comparación con los sistemas existentes.
Introduction
Además de los métodos bien establecidos (confocal o de múltiples fotones microscopía de escaneo láser 1-4, iluminación estructurada de microscopía 5,6) de lámina de luz o microscopía de iluminación plano único (SPIM) ha demostrado ser un valioso método de formación de imágenes 3D 7,8, 9. De particular interés es su aplicación a cultivos de células de 3 dimensiones, por ejemplo, esferoides tumorales multicelulares (MCT), que se utilizan cada vez más para la investigación de descubrimiento de fármacos 10,11. Además, SPIM es un método preferencial cuando incluso después de la exposición a largo plazo o mediciones repetitivas se requieren dosis bajas de luz para mantener la viabilidad de la muestra, ya que para la medición de cada plano de la muestra sólo este plano se expone a la luz. Esto está en contraste con otras técnicas de microscopía, donde para la detección de cada plano focal se ilumina toda la muestra, de modo que tras la grabación de numerosos planos las sumas dosis de luz y puede dañar la muestra 12. </p>
Microscopía de lámina de luz o SPIM se basa en la iluminación de la muestra en dirección perpendicular a la trayectoria de observación ya sea mediante el uso de una lente cilíndrica o escaneando el haz de láser excitante (para una revisión ver ref. 8). Esto a menudo requiere cámaras de muestras especiales 13,14 o matrices, por ejemplo, agarosa 7,15, implementado en los microscopios especiales de alto costo. Como una alternativa a los sistemas de un dispositivo de iluminación sencilla comparable para SPIM se ha desarrollado y adaptado a un microscopio invertido convencional 16 (véase la Figura 1). Se compone de un haz de láser expandido a un diámetro de 8 mm y enfocada por una lente cilíndrica (longitud focal: 50 mm, apertura numérica: 0,08) a una hoja de luz de 6-10 micras de espesor sobre una profundidad de campo de aproximadamente 100 micras . Las muestras se encuentran en un capilar rectangular de 600-900 m de diámetro interior colocado delante del microscopio len objetivos para la detección de fluorescencia. Estas características principales están actualmente completado y optimizado por el uso de enfoques micro-capilares avanzadas para sujetar y para la rotación de las muestras, el ajuste sincrónico de la hoja de luz de iluminación (en dirección axial) y la lente del objetivo utilizados para la detección de fluorescencia (camino óptico idéntico longitudes de desplazamiento requieren una corrección de la alimentación mecánica), y la adaptación de un sistema de microfluidos para la aplicación de tintes fluorescentes, agentes farmacéuticos o medicamentos, minimizando de este modo las cantidades y los gastos necesarios.
Protocol
Representative Results
Discussion
El presente manuscrito describe una hoja de luz o microscopía de iluminación plano único (SPIM) del dispositivo que está optimizado para sistemas de células de 3 dimensiones, por ejemplo, esferoides tumorales multicelulares (MCT). Tres aplicaciones ejemplares incluyen (1) la absorción de un fármaco citostático y su conversión parcial a un producto de degradación (cuya contribución a la eficacia de la quimioterapia sigue siendo ser evaluado), (2) mediciones del estado redox mediante el uso de un senso…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este proyecto fue financiado por el Estado federado de Baden-Württemberg, así como por la Unión Europea, Europäischer Fonds für die Regionale Entwicklung. Los autores agradecen a Rainer Wittig (ILM Ulm) para proporcionar la línea celular U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 y Claudia Hintze para la asistencia técnica en un crack.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description(optional) |
| microtiter plate | Orange Scientific | 4430100 | for cell spheroid growing |
| agarose | Carl Roth GmbH | 3810.1 | for cell spheroid growing |
| MCF-7 cell line | CLS Cell Lines Service GmbH | 300273 | cell line |
| U251-MG-L106 cell line | cell line | ||
| DMEM | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG0435 | culture medium |
| DMEM/Ham's F-12 | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG4815 | culture medium |
| FCS | Biochrom AG (Merck Millipore) | S0615 | cell culture supplement |
| penicillin/streptomycin | Biochrom AG (Merck Millipore) | A 2213 | antibiotics |
| hygromycin B | PAA Laboratories | P02-015 | antibiotic |
| EBSS | Sigma-Aldrich Inc. | E3024 | cell culture supplement |
| doxorubicin | Sigma-Aldrich Inc. | D1515 | fluorescent dye (CAUTION: acute toxicity) |
| green cytotoxicity dye | Promega GmbH | G8742 | CellTox – fluorescent cytotoxicity dye |
| rotenone | Sigma-Aldrich Inc. | R8875 | cellular inhibitor (CAUTION: acute toxicity) |
| hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich Inc. | 95302 | reagent for oxidation (CAUTION: acute toxicity) |
| capillary | VitroCom | 8260-050 | sample preparation |
| microscope | Carl Zeiss Jena | Axiovert 200M | |
| AxioCam MRc CCD-camera | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | 426508-9901-000 | CCD-camera |
| AxioVision data aquisition software | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | version 4.8.2. | |
| laser diode | Pico Quant GmbH | LDH-P-C-470 | used with driver PDL800-B |
| perestaltic pump | Ismatec Labortechnik | MS-1 Reglo | re-callibrated to reduce the minimum pump speed by 1/10 |
| silicone tubes | IDEX Health & Science GmbH | TYGON R3607 |
References
- Pawley, J. . Handbook of biological confocal microscopy. , (1990).
- Webb, R. H. Confocal optical microscopy. Rep. Prog. Phys. 59, 427-471 (1996).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- König, K. Multiphoton microscopy in life sciences. J. Microsc. 200 (2), 83-104 (2000).
- Neil, M. A., Juskaitis, R., Wilson, T. Method of obtaining optical sectioning by using structured light in a conventional microscope. Opt. Lett. 22 (24), 1905-1907 (1997).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Huisken, J., Swoger, J., del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by SPIM. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Huisken, J., Stainier, D. Y. R. Selective plane illumination microscopy techniques in development biology. Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J. Histochem. Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high throughput screening: the multi-cellular spheroid model. J. Biomol. Screen. 9 (4), 273-285 (2004).
- Schneckenburger, H., et al. Multi-dimensional fluorescence microscopy of living cells. J. Biophotonics. 4 (3), 143-149 (2011).
- Schneckenburger, H., et al. Light exposure and cell viability in fluorescence microscopy. J. Microsc. 245 (3), 311-318 (2012).
- Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. P., Kubitschek, U. Light sheet microscopy for single molecule tracking in living tissue. PLoS One. 5 (7), e11639:1-e11639:7 (2010).
- Mertz, J., Kim, J. Scanning light-sheet microscopy in the whole mouse brain with HiLo background rejection. J. Biomed. Opt. 15 (1), 016027 (2010).
- Fahrbach, F. O., Rohrbach, A. A line-scanned light-sheet microscope with phase shaped self-reconstructing beams. Opt. Express. 18 (23), 24229-24244 (2010).
- Bruns, T., Schickinger, S., Wittig, R., Schneckenburger, H. Preparation strategy and illumination of 3D cell cultures in light-sheet based fluorescence microscopy. J. Biomed. Opt. 17 (10), 101518 (2012).
- Ma, H. L., et al. Multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model for three-dimensional imaging of chemotherapeutic and nano material cellular penetration. Mol. Imaging. 11 (6), 487-498 (2012).
- Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. Cholesterol dependent uptake and interaction of doxorubicin in MCF-7 breast cancer cells. Int. J. Mol. Sci. 14 (4), 8358-8366 (2013).
- Hovorka, O., et al. Spectral analysis of doxorubicin accumulation and the indirect quantification of its DNA intercalation. Eur. J. Pharm. Biopharm. 76 (3), 514-524 (2010).
- Schickinger, S., Bruns, T., Wittig, R., Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. Nanosecond ratio imaging of redox states in tumor cell spheroids using light sheet-based fluorescence microscopy. J. Biomed. Opt. 18 (12), 126007 (2013).
- Lippert, H., Wald, M., Radt, B. Optical arrangement for the production of a light sheet. U.S. Patent. , (2010).
- Lorenzo, C., et al. Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy. Cell Division. 6 (22), 1-8 (2011).
- Bruns, T., Schneckenburger, H., Schickinger, S. Sample holder for rotation of three-dimensional specimens in microscopy. European Patent Application. , (2013).
