Single Plane Verlichting Module en Micro-capillaire Aanpak voor een Wide-field microscoop
Summary
Een module voor enkel vlak verlichting microscopie (SPIM) beschreven die gemakkelijk wordt aangepast om een omgekeerde wide-field microscoop en geoptimaliseerd voor 3-dimensionale celculturen. Het monster is gelegen in een rechthoekige capillaire en via een microfluïdische systeem fluorescente kleurstoffen kunnen farmaceutische middelen of geneesmiddelen in kleine hoeveelheden worden toegepast.
Abstract
Een module voor lichte sheet of enkel vlak verlichting microscopie (SPIM) beschreven die gemakkelijk wordt aangepast om een omgekeerde wide-field microscoop en geoptimaliseerd voor 3-dimensionale celculturen, bijvoorbeeld meercellige bolvormige tumoren (MCTS). De SPIM excitatie module vormen en buigt het licht zodanig dat het monster wordt verlicht door een lichtbron plaat loodrecht op het detectiepad van de microscoop. Het systeem wordt gekenmerkt door het gebruik van een rechthoekige capillaire voor het houden (en in een geavanceerde versie ook een micro-capillaire benadering voor het roteren) de monsters bij synchrone verstelling van de lichtdoorlatende plaat licht en de objectieflens voor fluorescentiedetectie en door aanpassing van een microfluïdische systeem voor de toepassing van fluorescente kleurstoffen, farmaceutische middelen of geneesmiddelen in kleine hoeveelheden. Een protocol voor het werken met dit systeem wordt gegeven, en enkele technische gegevens gerapporteerd. Representatieve resultaten omvatten (1) metingen van de upnemen van een cytostaticum (doxorubicine) en de gedeeltelijke omzetting in een afbraakproduct, (2) redox metingen met behulp van een genetisch gecodeerde glutathion sensor na toevoeging van een oxidatiemiddel, en (3) initiatie en etikettering van celnecrose op remming van de mitochondriale ademhalingsketen. Verschillen en voordelen van de onderhavige SPIM module ten opzichte van bestaande systemen worden besproken.
Introduction
Naast gevestigde werkwijzen (confocale of meerdere foton laser scanning microscopie 1-4, gestructureerde verlichting microscopie 5,6) lichtwaaier of enkel vlak verlichting microscopie (SPIM) blijkt een waardevolle werkwijze voor 3D beeldvorming 7,8 zijn, 9. Van bijzonder belang is de toepassing ervan op 3-dimensionale celculturen, bijvoorbeeld, meercellige bolvormige tumoren (MCTS), die steeds meer worden gebruikt voor het geneesmiddelenonderzoek 10,11. Bovendien SPIM een preferentieel methode wanneer zelfs na langdurige blootstelling of herhaalde metingen lage lichtdosis moeten levensvatbaarheid van het monster te handhaven aangezien voor het meten van elk vlak van het monster enige dit vlak wordt blootgesteld aan licht. Dit in tegenstelling tot andere microscopische technieken, waarbij voor detectie van elke focal plane het gehele monster wordt verlicht, zodat bij opnamen van meerdere vlakken de lichtdosis vat en kan als monster 12 worden beschadigd. </p>
Lichtwaaier microscopie of SPIM is gebaseerd op verlichting van het monster in loodrechte richting op de waarneming pad hetzij door gebruik van een cilindrische lens of door het scannen van de spannende laserstraal (voor een overzicht zie Ref. 8). Dit vereist vaak speciale monstercompartimenten 13,14 of matrices, bijvoorbeeld agarose 7,15, in speciale high-cost microscopen geïmplementeerd. Als alternatief voor deze systemen een relatief eenvoudige verlichtingsinrichting voor SPIM ontwikkeld en aangepast om een conventionele omgekeerde microscoop 16 (zie figuur 1). Het bestaat uit een laserstraal uitgebreid tot een diameter van 8 mm en gefocusseerd door een cilindrische lens (brandpuntsafstand: 50 mm, numerieke opening: 0,08) een lichte vel van 6-10 urn dikte over een scherptediepte van ongeveer 100 urn . Monsters worden in een rechthoekige capillaire van 600-900 urn binnendiameter geplaatst voor het microscoopobjectief lens voor fluorescentiedetectie. De voornaamste kenmerken worden thans voltooid en geoptimaliseerd door het gebruik van geavanceerde micro-capillaire benaderingen voor het vasthouden en roteren van de monsters, de synchrone aanpassing van het lichtdoorlatende lichtwaaier (in axiale richting) en de objectieflens voor fluorescentiedetectie (identiek lichtweg lengten van verplaatsing vereisen een correctie van de mechanische aanvoer), en het aanpassen van een microfluïdische systeem voor de toepassing van fluorescente kleurstoffen, farmaceutische middelen of geneesmiddelen, waardoor de vereiste hoeveelheden en kosten minimaliseren.
Protocol
Representative Results
Discussion
De onderhavige manuscript beschrijft een lichtwaaier of enkel vlak verlichting microscopie (SPIM) inrichting die is geoptimaliseerd voor 3-dimensionele celsystemen, bijvoorbeeld meercellige bolvormige tumoren (MCTS). Drie illustratieve toepassingen omvatten (1) opname van een cytostaticum en de gedeeltelijke omzetting in een afbraakproduct (waarvan de bijdrage aan chemotherapeutische werkzaamheid nog worden geëvalueerd), (2) metingen van de redox toestand door toepassing van een genetisch gecodeerde glutathion…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit project werd gefinancierd door de deelstaat Baden-Württemberg, alsmede door de Europese Unie, Europäischer Fonds für die Regionale Entwicklung. De auteurs danken Rainer Wittig (ILM Ulm) voor het verstrekken van de U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 cellijn en Claudia Hintze voor bekwame technische bijstand.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description(optional) |
| microtiter plate | Orange Scientific | 4430100 | for cell spheroid growing |
| agarose | Carl Roth GmbH | 3810.1 | for cell spheroid growing |
| MCF-7 cell line | CLS Cell Lines Service GmbH | 300273 | cell line |
| U251-MG-L106 cell line | cell line | ||
| DMEM | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG0435 | culture medium |
| DMEM/Ham's F-12 | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG4815 | culture medium |
| FCS | Biochrom AG (Merck Millipore) | S0615 | cell culture supplement |
| penicillin/streptomycin | Biochrom AG (Merck Millipore) | A 2213 | antibiotics |
| hygromycin B | PAA Laboratories | P02-015 | antibiotic |
| EBSS | Sigma-Aldrich Inc. | E3024 | cell culture supplement |
| doxorubicin | Sigma-Aldrich Inc. | D1515 | fluorescent dye (CAUTION: acute toxicity) |
| green cytotoxicity dye | Promega GmbH | G8742 | CellTox – fluorescent cytotoxicity dye |
| rotenone | Sigma-Aldrich Inc. | R8875 | cellular inhibitor (CAUTION: acute toxicity) |
| hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich Inc. | 95302 | reagent for oxidation (CAUTION: acute toxicity) |
| capillary | VitroCom | 8260-050 | sample preparation |
| microscope | Carl Zeiss Jena | Axiovert 200M | |
| AxioCam MRc CCD-camera | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | 426508-9901-000 | CCD-camera |
| AxioVision data aquisition software | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | version 4.8.2. | |
| laser diode | Pico Quant GmbH | LDH-P-C-470 | used with driver PDL800-B |
| perestaltic pump | Ismatec Labortechnik | MS-1 Reglo | re-callibrated to reduce the minimum pump speed by 1/10 |
| silicone tubes | IDEX Health & Science GmbH | TYGON R3607 |
References
- Pawley, J. . Handbook of biological confocal microscopy. , (1990).
- Webb, R. H. Confocal optical microscopy. Rep. Prog. Phys. 59, 427-471 (1996).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- König, K. Multiphoton microscopy in life sciences. J. Microsc. 200 (2), 83-104 (2000).
- Neil, M. A., Juskaitis, R., Wilson, T. Method of obtaining optical sectioning by using structured light in a conventional microscope. Opt. Lett. 22 (24), 1905-1907 (1997).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Huisken, J., Swoger, J., del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by SPIM. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Huisken, J., Stainier, D. Y. R. Selective plane illumination microscopy techniques in development biology. Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J. Histochem. Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high throughput screening: the multi-cellular spheroid model. J. Biomol. Screen. 9 (4), 273-285 (2004).
- Schneckenburger, H., et al. Multi-dimensional fluorescence microscopy of living cells. J. Biophotonics. 4 (3), 143-149 (2011).
- Schneckenburger, H., et al. Light exposure and cell viability in fluorescence microscopy. J. Microsc. 245 (3), 311-318 (2012).
- Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. P., Kubitschek, U. Light sheet microscopy for single molecule tracking in living tissue. PLoS One. 5 (7), e11639:1-e11639:7 (2010).
- Mertz, J., Kim, J. Scanning light-sheet microscopy in the whole mouse brain with HiLo background rejection. J. Biomed. Opt. 15 (1), 016027 (2010).
- Fahrbach, F. O., Rohrbach, A. A line-scanned light-sheet microscope with phase shaped self-reconstructing beams. Opt. Express. 18 (23), 24229-24244 (2010).
- Bruns, T., Schickinger, S., Wittig, R., Schneckenburger, H. Preparation strategy and illumination of 3D cell cultures in light-sheet based fluorescence microscopy. J. Biomed. Opt. 17 (10), 101518 (2012).
- Ma, H. L., et al. Multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model for three-dimensional imaging of chemotherapeutic and nano material cellular penetration. Mol. Imaging. 11 (6), 487-498 (2012).
- Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. Cholesterol dependent uptake and interaction of doxorubicin in MCF-7 breast cancer cells. Int. J. Mol. Sci. 14 (4), 8358-8366 (2013).
- Hovorka, O., et al. Spectral analysis of doxorubicin accumulation and the indirect quantification of its DNA intercalation. Eur. J. Pharm. Biopharm. 76 (3), 514-524 (2010).
- Schickinger, S., Bruns, T., Wittig, R., Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. Nanosecond ratio imaging of redox states in tumor cell spheroids using light sheet-based fluorescence microscopy. J. Biomed. Opt. 18 (12), 126007 (2013).
- Lippert, H., Wald, M., Radt, B. Optical arrangement for the production of a light sheet. U.S. Patent. , (2010).
- Lorenzo, C., et al. Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy. Cell Division. 6 (22), 1-8 (2011).
- Bruns, T., Schneckenburger, H., Schickinger, S. Sample holder for rotation of three-dimensional specimens in microscopy. European Patent Application. , (2013).
