Isolamento e Cultura de Dissociated neurônios sensoriais de Chick Embriões

Os neurônios são células complexas que levam informações essenciais para uma variedade de funções, incluindo a sensação, visão, movimento motor, aprendizagem e memória. Único a partir de outros tipos de células, os neurônios estender os processos de braço-like, chamadas axônios, para formar rodovias neurais essenciais para a comunicação. Durante o desenvolvimento especializada compartimentos localizados na ponta dos axônios em crescimento, chamados cones de crescimento, navegar através de um concerto de sinais extracelulares para liderar o axônio para o seu destino apropriado. Os mecanismos moleculares que estão na base intrincadas do cone de crescimento de navegação não são completamente compreendidos. Para entender melhor esses mecanismos, os pesquisadores usaram modelos de cultura de células para estudar neurônios em um ambiente vitro definido e simplificado. Estudar neurônios em cultura ¹ levou a avanços significativos em nossa compreensão da biologia de células neuronais, incluindo: a diferenciação neuronal ^2, a dinâmica do citoesqueleto, endocitose e tráfico, dendritoregulação ^3,4, a regeneração axonal ^5, e as condições clínicas, tais como neuropatias ^6. Além disso, os neurónios em cultura são altamente susceptível a uma vasta gama de técnicas de pesquisa, incluindo a imunocitoquímica, de células da superfície de co-imunoprecipitação, transferência Western, transfecção, ARNi, e imagens em tempo real, tais como análise de Timelapse cone de crescimento motilidade. Assim, a cultura de neurônios primários é uma abordagem poderosa para elucidar vários aspectos da biologia celular dos neurônios.

O modelo de cultura celular fornece investigadores com controle detalhado sobre as condições ambientais e variáveis. Por exemplo, o substrato sobre o qual os neurónios foram semeadas (e crescer em cima) pode ser facilmente manipulado. Aqui, nós fornecemos instruções detalhadas para a geração de dois substratos distintos, um com uma baixa concentração de laminina-1 e outro com concentrações de saturação de laminina-1. Surpreendentemente, concentrações diferentes da mesma molécula pode ter efeitos dramáticossobre o estado interno de neurónios, bem como a sua composição da superfície da célula. Por exemplo, os níveis intracelulares de cAMP e níveis de superfície de integrinas são significativamente diferentes nos neurónios plaqueados sobre estes dois substratos ^7,8. Outros estudos têm mostrado que outras moléculas, incluindo fibronectina e proteoglicanos de sulfato de condroitina, o impacto da expressão de moléculas da superfície celular e a motilidade neuronal ^7-11. Além disso, as moléculas solúveis, tais como neurotrofinas e neurotropins também afectar a composição da membrana celular e a motilidade neuronal e ^12-16 podem ser facilmente e com precisão manipulado em um modelo de cultura de células.

Aqui, descrevemos os métodos para isolar e cultura dissociada neurônios sensoriais a partir de embriões de galinha. Este procedimento tem sido usado para fazer avanços significativos em neurobiologia, incluindo axônio conseqüência ^{5,7,8,10,11,16-21} e foi modificado a partir de um procedimento destinado a isolar as células ganglionares ^22. Temvárias vantagens para esta abordagem. Em primeiro lugar, muitas características da garota gânglio da raiz dorsal (DRG) desenvolvimento estão bem caracterizados, incluindo o período de tempo para o parto, a extensão do axônio, e expressão da proteína perfis ^2,23-28, proporcionando assim uma base instrutiva sobre a qual construir informativo experimentos in vitro. Em segundo lugar, dissociado culturas neuronais permitem ao investigador para estudar mais directa em comparação com os neurónios de abordagens alternativas que utilizam explantes DRG intactos (que contêm neurónios e células não neuronais) e / ou culturas mistas que contêm ambos os neurónios dissociados e células não-neuronais. Em terceiro lugar, o procedimento descrito aqui é simples, barato e passível de graduação. Portanto, essa técnica pode ser usada para pesquisa, bem como para fins de ensino. Além disso, pequenas variações deste protocolo deve permitir a purificação rápida, alto rendimento de neurônios a partir de outras fontes de GDH. Por exemplo, este procedimento pode ser modificado para proporcionar neuronalmente enriched culturas de outros tecidos, tais como prosencéfalo embrionário ou da medula espinal.

Imunocitoquímica protocolos foram optimizados para estas culturas neuronais dissociadas e são descritos em detalhe aqui. O procedimento para a imunocitoquímica dupla contra molécula de adesão de células neurais (NCAM) e integrinas β1 é fornecido. Os dados gerados a partir destes métodos imunocitoquímicos foram utilizados para examinar o padrão espacial e intensidade de várias moléculas em neurónios cultivados ^8,16.