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医学

Konfokale Zeitraffer Imaging als eine effiziente Methode für die Bewertung der Cytocompatibility Dental Composites

Published: November 09, 2014
doi:
10.3791/51949
, , ,
1Laboratoire des Multimatériaux et Interfaces,UMR CNRS 5615, Université Lyon1, 2UFR d’Odontologie, Université Lyon1; Service de Consultations et de Traitements Dentaires,Hospices Civils de Lyon, 3UFR d’Odontologie, Université Paris Diderot; Service d’Odontologie,APHP, Hôpital Rothschild

Summary

Die am besten untersuchten Aspekt der Biokompatibilität von dentalen Kompositen ist ihre Zytotoxizität 3D CLSM Zeitraffer Bildgebung in Kombination mit Fluoreszenzsignal Quantifizierung ermöglicht sensible Auswertung des Zellschicksals im Laufe der Zeit. Unter Verwendung dieser Methode könnte ein effizientes Werkzeug, um den cytocompatibility von dentalen Kompositen beurteilen.

Abstract

Es ist allgemein anerkannt, dass in vitro Zellmaterial Wechselwirkung ein nützliches Kriterium bei der Bewertung der Biokompatibilität Dentalmaterial ist. Das Ziel dieser Studie war es, 3D CLSM Zeitraffer konfokale Bildgebung verwenden, um die in vitro Biokompatibilität von dentalen Kompositen beurteilen. Dieses Verfahren liefert eine genaue und empfindliche Anzeige der Lebendzellrate in Kontakt mit Zahnverbundextrakten. Die ELS zusätzliche geringe Schrumpfung, ein Dentalverbund für direkte Restauration verwendet, wurde als Beispiel genommen worden. In vitro Beurteilung am kultivierten primären humanen gingivalen Fibroblasten mit Live / Dead-Färbung durchgeführt. Die Bilder wurden mit dem konfokalen FV10i biologischen invertierten Systems erhalten und mit der FV10-ASW 3.1 Software analysiert. Die Bildanalyse zeigte eine sehr geringe Zytotoxizität in Gegenwart der getesteten Verbund nach 5 Stunden im Zeitraffer. Eine leichte Abnahme der Lebensfähigkeit der Zellen wurde in Kontakt mit der getesteten Verbund Extrakte Vergleichbarkeit gezeigtened zu Kontrollzellen. Die Ergebnisse unterstrich die Verwendung von 3D-CLSM Zeitraffer Bildgebung als empfindliche Methode, um die Biokompatibilität Verhalten Dentalkomposite qualitativ und quantitativ zu bewerten.

Introduction

Einer der Hauptstandards in den ISO Empfehlungen angegeben werden, um die Biokompatibilität zu definieren, ist das Fehlen des Materials Zelltoxizität. Zahnärztliches Verbundstoffe können Komponenten aus der Harzmatrix, die zunächst durch teilweise Polymerisation sein können, und / oder später aufgrund von Abbauprozessen im Laufe der Zeit frei 1-4. Diese freigesetzten Komponenten in Kontakt mit oralen Gewebe kommen und kann verschiedene Nachteile wie Urtikaria und Schleimhautreaktionen 5, Entwicklung von Allergien und Überempfindlichkeitsreaktionen bei Patienten 6, Modifikationen Gingivafibroblasten Morphologie und Reduktion auf Kollagen Typ I Protein 7, Immunsuppression oder Immunstimulation auf Mitogen haben -driven Proliferation von gereinigten T-Lymphozyten und Milzzellen 8 und DNA-Schäden in primären humanen gingivalen Fibroblasten, die deren gentoxische Potenzial 9 unterstreicht. Viele Parameter können Dentalverbund Toxizität, wie der Farbton der c auswirkenomposite der Lichthärtung, die chemische Zusammensetzung des Harzes Monomer, dem Füllstoff und der Umwandlungsgrad 10- 13. Da in vitro toxische Potential der Materialien können in vivo Situationen vorherzusagen und kann zu klinischen Situationen, die von der Untersuchung einiger relevanter Endpunkte verglichen werden. Die Zytotoxizität von dentalen Kompositen und deren Komponenten wurden weitgehend unter Verwendung von Zellkultursystemen 14- 16 ausgewertet.

Diese in vitro-Systeme entwickelt worden, um Dentalkompositen Biokompatibilität in der Bezeichnung der Beurteilung: Zellwachstum und Apoptose mit THP-1monocytes wie Zellen 17, Cytotoxizität in menschlichen Gingivafibroblasten 18, Entzündungspotential in HaCaT Keratinozyten wie Zellen 2, die Zellfunktionalität odontoblast- wie MDPC-23-Zellen 19, Reduzierung der Gesamt-RNA Levels und signifikante Erhöhung der Induktion der Apoptose auf die menschliche Zahnfleisch Keratinozyten 20 undDNA-Schäden auf gingivalen und Zellstoff-Fibroblasten-Zellen 21.

Verschiedene Methoden werden vorgeschlagen, um die Biokompatibilität von dentalen Kompositen zu untersuchen. Kolorimetrische Assays, die spezifische Farbstoffe und Licht Adsorption Messungen beinhalten, bleiben die am häufigsten verwendet wird, die aufgrund ihrer relativen Einfachheit und niedrige Kosten 22- 26. Mikroskopie Analyse durch Lichtkontrast verbraucht häufig mehr Zeit und verursacht höhere Kosten. Jedoch haben diese Mikroskopietechniken einige wichtige Vorteile. Die Beobachtung der Zellstruktur gibt erweiterte Informationen über erfahrene toxischen Wirkungen, wodurch relevanter und sensiblen Daten. Insbesondere wurde die Einführung von Konfokalmikroskopie 27 für die Beobachtung von biologischen Strukturen mit einer Verbesserung axiale Auflösung im Vergleich zu herkömmlichen Weitfeldabbildungsfluoreszenzmikroskopen erlaubt. Daher hat konfokale Bildgebung zu einem mächtigen Ermittlungswerkzeug in verschiedenen Bereichen derMedizin und Wissenschaft Forschungen. Im Gegensatz zu elektronischen Mikroskopie-Techniken bietet konfokalen Rastermikroskopie in der Lage, verschiedene Komponenten der Zellen durch Einbau von speziellen Fluoreszenzmarker zu visualisieren. Die meisten dieser spezifischen Tracer in einer wäßrigen Umgebung stabil ist, sinnvoll meßbar, kostengünstig und ungiftig 28, so dass ihre Verwendung in der klinischen als auch Laborforschungsstudien. Außerdem ist nicht zu Zeitraffer konfokale Bildgebung notwendig die Probe Trocknung und Fixierung für herkömmliche Elektronenmikroskopie-Analyse erforderlich ist, ist somit zeitabhängigen Erfassungs auch an Proben. Verglichen mit dem zweidimensionalen Bilderzeugungs der konfokalen Abbildungsprinzip ermöglicht eine Probenuntergrund Visualisierung und die dreidimensionale Struktur Rekonstruktion der verschiedenen erhaltenen Tiefenbilder; das dazu führen, präziser und strukturelle Details 29, 30. Die vorliegende Videostudie ist ein Beispiel für die Verwendung von dreidimensionalen Zeitraffer-Confocal Laser Scanning Mikroskopie (3D-CLSM), kombiniert mit Live / Dead Fluoreszenzmarkierung und Signal Quantifizierung als innovative Methode. Die in diesem Papier vorgestellte Technik hat den Vorteil, dass empfindliche Auswertung und Zeitraffer-Imaging lebender Zellen ohne Änderung der veranlagten Zellstruktur. Keine Vorbereitungsschritte vor konfokale Analyse erforderlich. Zuvor wurde die gleiche Färbung zur Beurteilung der Lebensfähigkeit der kultivierten Spongiosa Kerne 31 aber ohne konfokale Zeitraffer folgenden verwendet. Ebenso die gleiche Zeitraffer konfokalen Verfahren wurde verwendet, um Erythromycin Zeit-kill-Aktivität zu bewerten in Bakterien von Belebtschlamm nach ihren Gram Typ 32 mit einem spezifischen Bakterien lebend / tot-Färbung. Diese Methoden wurden kürzlich angepaßt und verwendet, um die Toxizität von Dentalverbundwerkstoffen auf Basis von Methacrylat-Monomeren, 11 zu vergleichen.

Protocol

Das Protokoll besteht aus drei Hauptschritten: Der erste Schritt umfasst die Herstellung von Composite-Extrakt in Kulturmedien; Der zweite betrifft die primären humanen Gingivafibroblasten (HGF) Zellkultur, der Kontakt der Zellen mit den Verbundextrakten und Zellfärbung; der dritte Schritt besteht in der konfokalen Abbildung und der Fluoreszenzsignalanalyse. Für Zahnfleischgewebe nehmen, wurde das Protokoll in Übereinstimmung mit Französisch Rechtsvorschriften, informierte Zustimmung und lokalen Ethikkommission genehmigt. 1. Composite Auszüge Vorbereitung Verwenden Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) als Elutionsmittel. Sicherzustellen, dass das Verhältnis zwischen der Oberfläche der Proben und dem Volumen des Extraktionsmediums ist auf der untersten Ebene der Anforderungen der ISO 10993/12. Die Vorgehensweise ist kürzlich beschriebenen 11 und skizziert im Folgenden kurz: Bilden kugelförmige Proben des ungehärteten Dentalkomposit mit einem maßgeschneiderten holdäh. Der Halter Größe 2 mm Radius, die in Übereinstimmung mit den allgemein empfohlen Härtungstiefe in der Mund klinischen Behandlung. Vorbereitung Plattenvertiefungen, die jeweils 1 ml Kulturmedium (DMEM) mit 5% Mischung von Penicillin / Streptomycin und 1% Amphotericin aber ohne fötales Rinderserum (FBS). Cure Proben innerhalb der Vertiefung mit DMEM-Medium mit einem LED-Lichtlampe mit 1070 mW cm -2 Intensität (λ = 465-475 nm) für 40 sec. Sicherzustellen, dass der Abstand zwischen der Spitze und Aushärtung der Proben in dem Bereich von 0,5 mm. Verwenden Sie diesen Modus, um die Härtung temporären Kontakt zwischen Zahn und dem nicht ausgehärteten Zahnverbund simulieren. In klinischen Situation tritt der Kontakt, wenn der Füllungsverbundstoff in der Mundhöhle platziert. Proben (Proben Komposite in DMEM-Medium) bei 37 ° C unter befeuchteter Atmosphäre mit 5% CO 2 in Luft. Inkubieren DMEM-Medium (ohne Mischproben) für Kontrollzellen bei den gleichen Bedingungen. 2. HGF Cell Culture, Composite Auszüge Prüf- und Zellen Färbung Wachstum und die Erhaltung von Zellkulturen Isolieren menschlichen Zahnfleisch Fibroblasten von gesunden Zahnfleischgewebebiopsien von Patienten während der Routinekieferorthopädische Extraktionen gemacht. Kultivieren menschlicher gingivalen Fibroblasten in DMEM in Gegenwart von 10% FBS, 5% Penicillin / Streptomycin und 1% Amphotericin B. Pflegen Zellen bei 37 ° C im Brutschrank unter einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 in Luft. Geänderte Medium alle 3 Tage, und Passage-Zellen alle 5 Tage. Nach Erreichen der Konfluenz, Ernte Zellen durch Trypsinierung. Zentrifugenzellen bei 90 × g für 5 min und resuspendieren sie in dem Kulturmedium. Graf Zelle mit einem Zepter Hand automatisierten Zellzählers. Samenzellsuspension mit einer Zelldichte von 2,5 x 10 4 Zellen / ml in einer Kammer Schiebersystem. Ermöglichen die Inkubation der Zellen über Nacht bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 5%. Zugabe von Verbund Extrakte zu den Zellen in Kultur Ersetzen Sie die Medien aus zwei Vertiefungen der Kammer Rutsche von 1 ml der getesteten Verbund Extrakte (nach 24 h Inkubation). Pflegen Sie die restlichen beiden Brunnen (Kontrollzellen) in den gleichen Bedingungen. Inkubieren der Kammer Folie mit den vier Vertiefungen bei 37 ° C im Brutschrank unter einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 in Luft. Fluoreszenzfärbung Verwenden Sie den Live / Dead Zytotoxizität Fleck für eukaryotische Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers. HINWEIS: Der Bausatz bietet eine schnelle Zweifarben-Fluoreszenz-Assays, um die Lebensfähigkeit von Zellen in einer Population basierend auf der Plasmamembranintegrität und Esterase-Aktivität zu bestimmen. Der Fleck Live unterscheiden von beschädigten Zellen durch gleichzeitige Markierung mit grünem fluoreszierenden Calcein-AM zu intrazellulären Esteraseaktivität und rot-fluoreszierende Ethidium Homodimer-1 (EthD-1), um anzuzeigen, Verlust von Membran zeigene Integrität. Vorbereiten einer Arbeitslösung der beiden Färbereagenzien, die 2 & mgr; M Calcein AM und 4 uM EthD-1 (Endkonzentration berichtet für Fibroblasten Färbung zu sein). Hinzufügen der Fleck zu den kultivierten adhärenten Zellen in der Anwesenheit oder Abwesenheit der ausgewählten Verbundextrakten. Beachten Sie direkt und schnell die gefärbten Zellpopulationen an der mindestens 15 min nach Färbung und durch den Zeitraffer-Bildgebung. Nicht schleudern und nicht die gefärbten Zellen fixe. 3. Konfokale Zeitraffer Bildgebung und Signalanalyse Das verwendete System ist mit vier Diodenlasereinheiten und einer Mehr gefärbten Bildes bis zu vier Fluoreszenzfarbstoffe für jede Probe ausgestattet. Das System kann eine Zuordnung Bild (10-facher Vergrößerung), die einen Überblick über die Testprobe auf dem man sich bewegen kann, um eine Region von Interesse (600X Vergrößerung) zu beobachten gibt zuführen. Zeitraffer-Aufnahme Legen Sie die specimens (enthaltend die Kammer Schieber die gefärbten Proben) auf dem dunklen Raum des konfokalen integrierten Inkubator (37 ° C, 5% CO 2 und feuchter Atmosphäre). Wählen Sie die entsprechenden Laser. Verwenden Sie die beiden Laserquellen 473 nm (15 mW) und 559 nm (18 mW) auf Calcein und EthD-1 anzuregen. Verwenden Sie ein zwei sequentiellen Modus, um Bilder durch die Leitung Sequenzen ohne Übersprechen in der Bildgebung mit den beiden verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe zu erwerben. Verwenden Sie einen Detektor mit einer neu entwickelten Spektrum an Bedingungen in Übereinstimmung mit dem Fluoreszenzfarbstoff in der Abtasteinheit automatisch eingestellt. Optimierung der Bandbreiten der detektierten Fluoreszenz für jeden Kanal auf das Maximum. Notieren Sie alle Akquisitionen sequentiell um mögliche Übersprechen zu vermeiden. Wählen Sie die am besten geeigneten Bilderzeugungsbedingungen auf der Basis der Fluoreszenzfarbstoff Auswahl mit der Erfassungssoftware. Erwerben Sie ein Kartenbild, die automatisch von der Mitte in einem Spiralmuster erzeugt wird,mit dem interessierenden Gebiet ist leicht zur genaueren Untersuchung ausgewählt. Wählen Beobachtungsmodus. Wählen Sie bis zu fünf Arten von Beobachtungs Modi inklusive Zeitraffer, Z-Stapel, und Multi-Bereich je nach Bedarf. Verwenden Sie eine Kombination von Z-Stapel und Zeitraffer-Modi in der vorliegenden Studie und füllen schnell die Bilderfassung, Ändern und schalten den Fluoreszenzfarbstoff. Alternativ überlagern die fluoreszierende und das Licht kontrastreiche Bilder mit einander. Live-Bild zu beobachten mit dem ausgewählten Punkt auf der linken unteren Kartenbildschirm. Bestimmen Sie den Imaging-Bereich mit Hilfe der Gestaltung und Zoomfunktionen. Gegebenenfalls wechseln zwischen den Anzeigen für jeden Typ von Fluoreszenz-Farbstoff. HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendete Mikroskop hat die gleiche Funktionalität wie ein Hoch herkömmlichen konfokalen in einem kompakten Design. Das Mikroskop ist mit umgekehrten Wasserimmersionsobjektive, die sich optimal für eine stabile Zeitraffer-Bildgebung an lebenden Zellen mit einer vereinfachten integrierten Inkubator geeignet sind ausgestattet. </li> Signalanalyse und Quantifizierung Verwenden Sie die Bildbearbeitungssoftware, um das Fluoreszenzsignal zu quantifizieren. Erhalten fünf Kartenbilder mit dem 10X-Objektiv für beide untersuchten Probe und Zellkontrolle. Erhalten 1.024 × 1.024 Pixel normale Bilder, mit einer 0,231 & mgr; m × 0,231 & mgr; m Pixelgröße. Speichern von Bildern als Olympus Format des Bildes (OIF) zur Signalanalyse. Dieses Format ermöglicht die Speicherung verschiedener Parametereinstellungen und Bilder zusammen. Verwenden Sie verschiedene Analysewerkzeuge (Messung der Intensitätsprofil, Intensitätsverhältnis zwischen den beiden verwendeten Kanäle). Bewahren Sie die maximale Projektionsbilder als 12 Bit / Pixel TIFF-Dateien. Preform statistischen Analysen mit dem R Commander Software. Analysieren Unterschiede mit Einwegvarianzanalyse (ANOVA) mit einer Wiederholungsprüfung. Bericht Ergebnisse als mittlere Standardabweichung (± SD) und die statistische Signifikanz bei p <0,05.

Representative Results

Abbildung 1 zeigt einen Überblick über die Live / Dead gefärbten Zellen erhaltenen Mapping Bilder (10X-Objektiv) sowohl für Steuerungs- und Zellen auf die getesteten Verbund Extrakte (ELS Klein Schrumpfung) ausgesetzt. Die dreidimensionale Struktur der Zellen konnte bei der Vergrößerung 600X visualisiert werden. Visualisierung der Zellen, die in der Steuerkammer und der Zellen in der Kammer in Gegenwart der getesteten Verbund Extrakte gesammelt gesammelt, in Abbildung 2 dargestellt. Die maximale Vorsprung (Ziel 60X) zeigt das Schicksal von ausgewählten Zellpopulationen zu Beginn der Zeitablauf (bei 15 min) und am Ende des Zeitablaufperiode (5 h). Fünfzig sieben Stapel von Bildern (xyzt mod-Scan, 39 Bilder pro Stapel, Voxel-Tiefe 1,00 um) wurden in dieser Zeit erhalten. Ein leichter Rückgang im grünen Fluoreszenzsignal und sehr leichte Variation in der rot fluoreszierenden wurden in exponierten Zellen erhalten. Keine signifikante Veränderung wurde zur Kontrolle beobachtetZellen. Verbund Extrakte exponierten Zellen angenommen ähnliche Spindelmorphologie zu Kontrollzellen; Morphologie wurde bei diesen Versuchsbedingungen verändert (obwohl die grüne Signalabnahme und die rote Signalzunahme in Gegenwart der getesteten Verbund). Die Bildanalyse wurde an fünf ausgewählten verschiedenen Bildstapeln entsprechend unterschiedlichen Zellpopulationen aus den erhaltenen Bildern für die getestete Verbundgeführt, verglichen mit negativen Kontrollzellen sowohl für grüne und rote Signal. Das Intensitätsprofil der gefärbten Zellen ist in 3 dargestellt; Die grünen und roten Signal Entwicklung der Zellen in Kontakt mit der getesteten Verbund war vergleichbar mit denjenigen von Kontrollzellen. Calcein und EthD-1 Fluoreszenzemissionsintensitäten wurden auf Kontrollzellen und Verbund exponierten Zellen gemessen. Die Messung wurde in einstündigen Intervallen für bis zu fünf Stunden durchgeführt. Das grün / rote Fluoreszenz-Verhältnis (basierend auf integrierten Intensitäten des grünen 495-515 nm und Rot 620-650 nm Signale) Wurde während der Zeitraffer-Zeitraum berechnet. Die Lebensfähigkeit Verhältnissen für die Kontroll und exponierten Zellen ELS extra low shrinkage Extrakte werden in der T 1 in der Lage dargestellt ist. In der Gegenwart der getesteten Verbund wurde der Prozentsatz an lebenden Zellen gefunden, daß etwas von 100% auf 93,9% nach 1 h zu verringern Kontakt. Signifikanter Unterschied zwischen dem getesteten Composite und der Negativkontrolle (Zellen ohne Verbundextrakte) nach 5 h der angegebenen Zeitraffer Zeitraum beobachtet. Abbildung 1: Übersicht Bild Kartierung zeigte in Gegenwart von Verbund Extrakte (ELS Klein Schrumpfung) zu Beginn des Zeitrafferperiode (t = 15 min) gefärbten Zellen bei Objektiv 10x, (A) Kontrollzellen und (B-Zellen). Grünflächen sind lebende Zellen und roten Bereiche sind beschädigte Zellen. HierinVersuchsbedingungen, keine Veränderung (sowohl für grüne und rote Fluoreszenz) wurde für Composites exponierten Zellen beobachtet, verglichen mit negativen Kontrollzellen. Abbildung 2: CLSM-Bilder am Ziel 60X einer Zellpopulation aus (A) Steuerkammer und (B) zusammengesetzte Extrakte Kammer in dem Anfang und dem Ende der Belichtung Zeitrafferperiode (I: 15 min und II: 5 h zuge ). Grünflächen sind lebende Zellen und roten Bereiche sind beschädigte Zellen. Das Panel der Bilder zeigte geringfügige Änderung der Intensitätssignal (leichte Abnahme der Grün-Signal und sehr leichten Anstieg der Rote). In Gegenwart von Verbund Extrakte wurden keine Veränderungen der Zellmorphologie beobachtet; aussetzen Zellen behielten ihre spindelförmige und fibroblastische Morphologie als Kontrollzellen. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "always"> Abbildung 3: Linienprofil im Zeitraffer-Mikroskopie beobachtet Zellen (A) Kontrollzellen (B) Composite-Extrakte exponierten Zellen, (I) bei 15 min und (II) bei 5 Std.. Keine sichtbare Veränderung der Grün-Signal evolution in Gegenwart der getesteten Verbund ungeachtet der Zeitkontakt. Allerdings wurde eine leichte Zunahme des roten Signals in der Gegenwart von Verbund nach 5 h von Kontakt beobachtet. Kontaktzeit (Stunde) Die Lebensfähigkeit der Zellen (%) 1 2 3 4 5 Kontrollzellen 100 100 100 </Td> 100 100 ELS zusätzliche geringe Schrumpfung ® 93,9 ± 7 91,3 ± 5 * 89,5 ± 3 * 87,6 ± 2 * 87,7 ± 3 * Tabelle 1:. Rate lebender Zellen HGF evolution nach 1, 2, 3, 4 und 5 Stunden der Berührung mit der Verbund Extrakte Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch Anfärben mit der Live / Dead Zytotoxizität Kit getestet. Die Daten zeigen Mittelwerte ± SD von fünf Bildern stapelt Analyse. Werte sind signifikant verschieden von den Kontrollzellen bei p <0,05.

Discussion

Biokompatibilität Materialverhalten ist die Voraussetzung Parameter auf, bevor die medizinische Verwendung bewertet werden. Internationale Standards decken Medizin ISO 10993 33 und speziell Dentalmaterialien ISO 7405 34. Das Fehlen der toxischen Wirkungen auf die umliegenden Zellen ist der Schlüssel Norm in der Biokompatibilität Auswertung solcher Materialien. Deshalb Zytotoxizitätstests hat eine solche Bedeutung bei der Beurteilung der Dentalmaterial Biokompatibilität 35-37. Das ISO vorgeschlagenen Prüfverfahren könnte man auf die Stoffwechselaktivität oder Membranintegrität basieren. Ausgewählte Endpunkte sollten spezielle Bedingungen für das Ranking schädliche Wirkungen durch ein Testmaterial, um die Zeit und die Kosten für die Beurteilung Assays zu minimieren induzierte folgen. Die aktuelle Methode der Untersuchung (3D konfokale Zeitraffer Bildgebung) ist Membran Integrität. Die Zytotoxizität Auswertung über diesen Endpunkt scheint ein wertvoller Marker von Zell biocompa seinträglichkeit mit getesteten Materialien und es ist auch ISO zugelassen Endpunkt. In vitro-Tests wurden entwickelt, um zu bestimmen, wie eine Materialprobe einen bestimmten Zelltyp betrifft. Die kolorimetrische MTT-Assay wurde ursprünglich von Mossman (1983) als eine nützliche Methode für die Messung der in vitro-Zytotoxizität und Zellproliferation beschrieben. Der MTT-Test basiert auf der Umwandlung von Tetrazoliumsalz in Formazan-Kristallen durch aktive Zellen, die mitochondriale Aktivität bestimmt basierend. Dies kann durch Überlebensrate 38 übersetzt werden. Gupta und Mitarbeiter berichteten, dass der MTT-Test ist der am weitesten verbreitete Methode zur Messung der Zytotoxizität Verbundharze. Succinsäure-Dehydrogenase und alkalischer Phosphatase Reaktionen wurden auch für den gleichen Zweck verwendet worden 39. Doch das Schicksal Zellen kann nicht gefolgt werden, da der MTT-Test erfordert die Zellen an jedem Messzeitpunkt zu töten. Um stärker in der aktuellen Studie überwachen das Verhalten der gefärbten Zellen, direct Beobachtung von lebenden Zellen durchgeführt wurde, dank Zeitraffer CLSM Bildgebung kombiniert mit einem kurzen Protokoll Färbung, automatisierte Bildanalyse und Fluoreszenzsignal Quantifizierung.

Dentalkomposite kommen in engen Kontakt mit Mundgewebe, insbesondere Zahnfleisch und Pulpa Zellen. 41 – Fibroblasten würde das Ziel der Bauteile aus diesen Verbundmaterialien Füllungs 40 freigegeben werden. Außerdem haben mehrere Studien berichtet, dass immortalisierte Zellen und primäre Zellen können unterschiedliche zelluläre Reaktionen in Kontakt mit Biomaterialien haben. Primäre Zellen erwiesen sich als besser geeignet, um Biomaterialien Effekte 42 beurteilen zu können. Dies erklärt die Verwendung von primären menschlichen gingivalen Fibroblasten als Zellmodell für die Bewertung der Cytotoxizität der getesteten Zahnverbundmaterial in der vorliegenden Studie. Die Toxizitätspotenzial der freigesetzten Stoffe aus Dentalkomposit wurde vielfach untersucht 43-44. Um zu beurteilen, ter zytotoxisches Potential von Materialien könnten zwei Kontaktmodell Zellen durchgeführt werden. Im direkten Kontakt Modellsystem das Material direkt mit den Zielzellen gebracht, während bei der indirekten Kontaktsystem, Zielzellen in Kontakt mit Eluate aus biologischen Medien. In der klinischen Anwendung und für restaurative Verfahren, sind Dentalkomposit in indirekten Kontakt mit Zahnfleischgewebe platziert. Aus diesem Grund wurde die aktuelle Versuchsprotokoll auf dem indirekten Kontaktsystem mit menschlichen gingivalen Fibroblasten (Zellen in Gegenwart der getesteten Verbundextrakte) konzentriert. Wie zuvor von Dahl und Mitarbeiter berichteten, wurden Zytotoxizität Antworten als schwere (<30%), mittel (30-60%), gering (60-90%) oder nicht-zytotoxischen (> 90%), bezogen auf die Aktivität in bezug auf Platz Werte für die Steuerelemente 45 erhalten. Daher wird gemäß der Rangliste und im Lichte der erzielten Ergebnisse (Tabelle 1), Composite ELS zusätzliche geringe Schrumpfung könnte als ver sortiert werdeny leicht zytotoxische und zeigten vergleichbare Verhalten an Zellen während des gesamten Zeitablauf Zeitraum steuern. Mit dem exakt gleichen Untersuchungsmethode konnten die Ergebnisse dieser Studie mit denen von einer kürzlich veröffentlichten Studie verglichen werden. Die ELS zusätzliche geringe Schrumpfung Verbund demonstriert überlegene Biokompatibilität im Vergleich zu den beiden zuvor getesteten Komposite für die gleiche klinische Anwendung, die die direkte Wiederherstellung 11 verwendet wird. Weitere Studien sind noch notwendig, um vollständigere Vergleich zu etablieren.

Bei der Entscheidung, welche Zytotoxizitätstest für einen bestimmten Endpunkt Beurteilung genehmigen, ist es wichtig, um die Vorteile und Grenzen der einzelnen Assay zu verstehen. Der Hauptzweck der konfokalen Abbildung ist, um eine 3-D-Architektur von Zellen und Organen zu erreichen. Die Technik ist in der Lage, nicht nur einer Probenoberfläche, sondern auch seine Untergrund offenbaren. Das hier beschriebene Protokoll unterstreicht die Verwendung von 3D-CLSM Zeitraffer konfokale Bildgebung, als Sensitive Methode, um die in vitro Biokompatibilität Verhalten eines Dentalverbund bewerten. Um jedoch die Einschränkungen in dieser Arbeit begegnet zu vermeiden, Anti-Vibrations-Arbeitsstationen könnten, um stabiler und länger Zeitraffer Bildgebung ermöglichen verwendet werden; Die Tischplatte kann die verwendete konfokalen Systems von den nachteiligen Wirkungen zu isolieren, daß Schwingungen im Labor verursachen. Weiterhin Materialien in der Mundhöhle verwendet werden, sollten im Idealfall unschädlich für die Zahnfleischgewebe sein und sollten keine Stoffe, die systemische Toxizität verursachen könnten. In Übereinstimmung mit der Methodik und den aus dem aktuellen Studie erhaltenen Ergebnissen kann gefolgert werden, daß die getesteten Verbund (ELS extra low shrinkage) ist in den vorliegenden experimentellen Bedingungen nicht zytotoxisch sein. Da der CLSM Verfahren feinfühlig die Anfangsrate der lebensfähigen Zellen zu geben, könnten andere Möglichkeiten vorgesehen werden, um mehrere Endpunkte beurteilen. Insbesondere, wie es wurde kürzlich berichtet, dass Verbund Monomere beeinflussen Zellen through reaktive Sauerstoffspezies (ROS) 46- 48, sind weitere Untersuchungen notwendig, um Zusammenhänge zu beurteilen, wenn eine zwischen Zytotoxizität Signalnetzwerke und ROS-Produktion. Die Zukunft Protokoll könnte so gestaltet werden, gleichzeitig auszuwerten ROS-Produktion (H 2 O 2 und / oder O 2 – Färbung) und Zytotoxizität Verhältnis (Live / Dead-Färbung) mit Zeitraffer CLSM Bildgebung.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Saremco Dental Switzerland and Olympus Microsystems France Companies are gratefully acknowledged for their financial support. Saremco Dental is also acknowledged for the generous donation of the dental composites ELS extra low shrinkage. The authors also wish to express their appreciation to Dr Simon Banks from the department of Chemistry (University College London) for his assistance with English revision.

Materials

Olympus Fluoview FV10i  Olympus Confocal microscope
O2/Co2 Incubator Pnasonic MCO 5M Cell incubation
Live/Dead® Kit Invitrogen  MP 03224 Stain 
ELS extra low shrinkage®  Saremco  Dental composite
DMEM medium Sigma D 6046 Culture medium
Trypsin Sigma T1426 harvesting cells
chamber slide system   PAA 14220040X Culture chamber
penicillin/streptomycin  PAA P11-010 Cell culture
Amphotericin B PAA P11-001 Cell culture
Foetal bovine serum  PAA A11-101 Cell culture
Cell Counter Merck Millipore 00110230TP1 Cell counting 
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Attik, G. N., Gritsch, K., Colon, P., Grosgogeat, B. Confocal Time Lapse Imaging as an Efficient Method for the Cytocompatibility Evaluation of Dental Composites. J. Vis. Exp. (93), e51949, doi:10.3791/51949 (2014).
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