JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
医学

Confocale Time Lapse Imaging als een efficiënte methode voor het Cytocompatibility Evaluatie van Dental Composites

Published: November 09, 2014
doi:
10.3791/51949
, , ,
1Laboratoire des Multimatériaux et Interfaces,UMR CNRS 5615, Université Lyon1, 2UFR d’Odontologie, Université Lyon1; Service de Consultations et de Traitements Dentaires,Hospices Civils de Lyon, 3UFR d’Odontologie, Université Paris Diderot; Service d’Odontologie,APHP, Hôpital Rothschild

Summary

De meest bestudeerde aspect van de biocompatibiliteit van tandheelkundige composieten is hun cytotoxiciteit 3D CLSM time lapse imaging gecombineerd met fluorescerende signaal kwantificering maakt gevoelige evaluatie van het lot van de cel in de tijd. Gebruik makend van deze methode kan een efficiënt instrument om de cytocompatibility van tandheelkundige composieten beoordelen.

Abstract

Het wordt algemeen aanvaard dat in vitro celmateriaal interactie een bruikbaar criterium bij de beoordeling van tandmateriaal biocompatibiliteit. Het doel van deze studie was om 3D CLSM time lapse confocale beeldvorming om de in vitro biocompatibiliteit van tandheelkundige composieten beoordelen. Deze methode verschaft een nauwkeurige en gevoelige indicatie van levensvatbare cel rate in contact met Composiet extracten. De ELS extra lage krimp, een Composiet gebruikt voor direct herstel, is genomen als voorbeeld. In vitro evaluatie werd uitgevoerd op gekweekte primaire menselijke gingival fibroblast cellen met Live / Dead kleuring. Beelden werden verkregen met de FV10i confocale biologische omgekeerde systeem en geanalyseerd met de FV10-ASW 3.1 Software. Beeldanalyse toonde een zeer geringe cytotoxiciteit in aanwezigheid van de geteste composiet na 5 uur tijdsverloop. Een lichte vermindering van cellevensvatbaarheid werd voorgesteld in contact met de geteste samengestelde extracten compared met controle cellen. De bevindingen benadrukt het gebruik van 3D CLSM time lapse imaging als een gevoelige methode om de biocompatibiliteit gedrag van tandheelkundige composieten kwalitatief en kwantitatief evalueren.

Introduction

Een van de belangrijkste eisen welke in de ISO aanbevelingen biocompatibiliteit definiëren is de afwezigheid van materiaal toxiciteit voor cellen. Hars dentale samenstellingen kunnen componenten van het harsachtige matrix, die aanvankelijk door gedeeltelijke polymerisatie kan zijn, en / of later door afbraakprocessen tijd 1-4 vrijgeven. Deze vrijgekomen componenten in contact met orale weefsels en kunnen verschillende nadelen zoals urticaria en slijmvliesreacties 5, ontwikkeling van allergie en overgevoeligheidsreacties bij patiënten 6, modificaties van gingivale fibroblasten morfologie en vermindering van type I collageen proteïne 7, immunosuppressie of immuunstimulatie op mitogeen hebben -driven proliferatie van gezuiverde T-lymfocyten en de milt cellen 8 en DNA-schade in primaire menselijke gingivale fibroblasten, die onderstreept van de genotoxische potentie 9. Veel parameters kunnen tandheelkundige toxiciteit composiet beïnvloeden, zoals de schaduw van de compositieplaten, de met licht uithardende, de chemische samenstelling van de hars monomeer, de vulstof en de omzettingsgraad 10- 13. Aangezien in vitro toxische potentieel van materialen kunnen voorspellen in vivo omstandigheden en kan worden vergeleken met klinische situaties door de analyse van enkele relevante eindpunten. De cytotoxiciteit van tandheelkundige composieten en hun componenten zijn op grote schaal geëvalueerd met behulp van celkweek systemen 14- 16.

Deze in vitro systemen ontwikkeld om tandheelkundige composieten biocompatibiliteit beoordelen termijn: celgroei en apoptose met THP-1monocytes achtige cellen 17, cytotoxiciteit in humane gingivale fibroblasten 18, inflammatoire potentieel HaCaT keratinocyten achtige cellen 2, celfunctionaliteit odontoblast- zoals MDPC-23 cellen 19, vermindering van de totale RNA-spiegels, en een significante toename van de inductie van apoptose op de menselijke tandvlees keratinocyten 20 enDNA schade aan het tandvlees en pulp fibroblastcellen 21.

Verschillende methoden worden voorgesteld om de biocompatibiliteit van tandheelkundige composieten onderzoeken. Colorimetrische assays, welke specifieke kleurstoffen en lichte adsorptiemetingen omvatten, blijven de meest gebruikte, vanwege hun relatieve eenvoud en lage kosten 22- 26. Microscopie analyse door licht contrast verbruikt vaak meer tijd en maakt hogere kosten. Echter, deze microscopische technieken hebben een aantal belangrijke voordelen. De waarneming van de celstructuur geeft uitgebreide informatie over ervaren toxische effecten, waardoor er meer relevante en gevoelige gegevens. In het bijzonder, heeft de introductie van confocale microscopie 27 toegelaten voor waarneming van biologische structuren verbeteren axiale resolutie dan traditionele wide-field imaging fluorescentie microscopen. Daarom heeft confocale beeldvorming uitgegroeid tot een krachtig onderzoeksinstrument in verschillende gebieden van demedische en wetenschappelijke onderzoeken. In tegenstelling tot elektronische microscopie, confocale microscopie biedt de mogelijkheid om afzonderlijke componenten van cellen te visualiseren door incorporatie van specifieke fluorescente merkers. De meeste van deze specifieke tracers stabiel in een waterige omgeving, verstandig meetbaar, goedkoop en niet-toxisch 28, waardoor het gebruik ervan in klinische en laboratoriumonderzoek studies. Bovendien, het monster drogen en bevestiging vereist conventionele elektronische microscopie analyse niet noodzakelijk time lapse confocale beeldvorming, waardoor tijdsafhankelijke acquisitie ook op monsters. Vergeleken met de tweedimensionale beeldvorming, het confocale beeldvorming principe kan een specimen ondergrond visualisatie en de driedimensionale structuur reconstructie uit de verschillende verkregen dieptebeelden; die resulteren in, preciezer en structurele details 29, 30. Deze video studie is een voorbeeld van het gebruik van drie-dimensionale tijdsverloopopname Confocal laser scanning microscopie (3D-CLSM) in combinatie met Live / Dead fluorescerend etikettering en signaal kwantificering als een innovatieve methode. De in dit document techniek heeft het voordeel dat gevoelige evaluatie en time-lapse beeldvorming van levende cellen zonder de beoordeelde celstructuur. Geen voorbereiding stappen nodig voordat confocale analyse. Voorheen werd dezelfde kleuring gebruikt voor de beoordeling van de levensvatbaarheid van gekweekte poreus bot cores 31 maar zonder confocale time-lapse volgende. Zo ook hetzelfde time-lapse confocale procedure werd gebruikt om erythromycine time-kill activiteit beoordelen in bacteriën van actief slib volgens hun Gram soort 32 met behulp van een specifieke bacteriën leven / dood kleuring. Deze methoden zijn onlangs aangepast en gebruikt om de toxiciteit van tandheelkundige composieten methacrylaat monomeren 11 vergelijken.

Protocol

Het protocol bestaat uit drie belangrijke stappen: de eerste stap omvat de bereiding van samengestelde extract in kweekmedium; de tweede heeft betrekking op de primaire humane Gingival fibroblasten (HGF) celkweek, het contact van de cellen met de samengestelde extracten en celkleuring; de derde stap uit confocale beeldvorming en het fluorescentiesignaal analyse. Voor tandvleesweefsels nemen, het protocol werd goedgekeurd in overeenstemming met de Franse wetgeving, informed consent en de lokale ethische commissie. 1. Composite Extracten Voorbereiding Gebruik Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) als elutiemedium. Zorg dat de verhouding tussen het oppervlak van de monsters en de hoeveelheid extractiemedium is op het laagste niveau van de ISO 10993/12 eisen. De procedure is onlangs beschreven 11 en schetste in het kort hieronder: Vormen sferische samples van de uitgeharde Composiet met behulp van een op maat gemaakte pakkenER. De houder is 2 mm in straal, die overeenkomstig algemeen geadviseerd uithardingsdiepte in de orale klinische behandeling. Bereid putjes, die elk 1 ml kweekmedium (DMEM), met een 5% mengsel van penicilline / streptomycine en 1% amfotericine zonder foetaal runderserum (FBS). Cure monsters binnen het putje met DMEM medium met behulp van een LED-lamp met een 1.070 mW cm -2 intensiteit (λ = 465-475 nm) gedurende 40 sec. Controleer of de afstand tussen het uitharden tip en de monsters in het gebied van 0,5 mm. Gebruik deze uitharden-modus om de tijdelijke contact tussen tand en de uitgeharde Composiet simuleren. In klinische situatie het contact plaatsvindt wanneer de herstelmaatregelen composiet wordt in de mondholte. Incubeer monsters (composieten specimens in DMEM medium) bij 37 ° C onder een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 in lucht. Incubeer DMEM medium (zonder samengestelde monsters) voor controle cellen onder dezelfde omstandigheden. 2. HGF Cell Culture, Composite Extracten Testing and Cells Kleuring Groei en behoud van celculturen Isoleer de menselijke gingivale fibroblasten van gezond tandvlees biopten van patiënten die tijdens routine orthodontische extracties. Cultiveren humane gingivale fibroblasten in DMEM in de aanwezigheid van 10% FBS, 5% penicilline / streptomycine en 1% amfotericine B. aanvullen cellen bij 37 ° C in een incubator onder bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 in lucht. Gewijzigde medium om de 3 dagen, en passage cellen om de 5 dagen. Na het bereiken van confluentie, oogst cellen door behandeling met trypsine. Centrifugeer cellen bij 90 xg gedurende 5 minuten en resuspendeer ze in het kweekmedium. Count cel met een scepter handheld geautomatiseerde celgetalmeter. Zaad celsuspensie bij een celdichtheid van 2,5 x 10 4 cellen / ml in een kamer geleidingssysteem. Laat de incubatie van de cellen overnacht bij 37 ° C in een atmosfeer van 5%. Toevoeging van samengestelde extracten aan de cellen in kweek Vervang de media van twee putjes van de kamer schuif door 1 ml van de geteste samengestelde extracten (na 24 uur incubatie). Handhaaf de twee overgebleven wells (controlecellen) onder dezelfde omstandigheden. Incubeer de kamer dia met vier putjes bij 37 ° C in incubator onder een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 in lucht. Fluorescentiekleuring Gebruik de Live / Dead cytotoxiciteit kleuring voor eukaryote cellen volgens instructies van de fabrikant. OPMERKING: de kit biedt een snelle twee-kleuren fluorescentie om de levensvatbaarheid van de cellen te bepalen in een populatie op basis van plasma membraan integriteit en esterase activiteit. De vlek onderscheiden levende van beschadigde cellen door gelijktijdig labelen met groen-fluorescent calceïne-AM intracellulaire esterase activiteit en rood-fluorescerende ethidiumhomodimeer-1 (EthD-1) aangeven verlies van membran aangevene integriteit. Bereid een werkoplossing van beide vlek reagentia die 2 uM calceïne AM en 4 uM EthD-1 (eindconcentratie gerapporteerd geschikt voor fibroblast kleuring is). Voeg de vlek aan de gekweekte hechtende cellen in de aanwezigheid of afwezigheid van de geselecteerde samengestelde extracten. Houd u direct en snel de gebrandschilderde celpopulaties ten minste 15 minuten na kleuring en door middel van de time-lapse imaging. Niet centrifuge en niet fixe de gekleurde cellen. 3. Confocal Time Lapse Imaging and Signal Analysis Het gebruikte systeem is uitgerust met vier diodelaser eenheden en beeld een multi-gekleurd tot vier fluorescente kleurstoffen voor elk specimen. Het systeem kan een mapping afbeelding (10x vergroting) die een overzicht geeft van het monster waarop men kan verhuizen naar een regio van belang (600X vergroting) observeren geeft presteren. Time lapse imaging Plaats de specimens (de kamer dia met de gekleurde monsters) op de donkere kamer van de confocale geïntegreerde incubator (37 ° C, 5% CO2 en vochtige atmosfeer). Het geëigende lasers. Gebruik de twee laser bronnen 473 nm (15 mW) en 559 nm (18 mW) te prikkelen Calceïne en EthD-1. Gebruik een twee sequentiële modus om afbeeldingen via lijn sequenties verwerven zonder overspraak in beeldvorming met de twee gebruikte fluorescentie kleurstoffen. Gebruik een detector met een nieuw ontwikkelde spectrum automatisch voorwaarden overeenkomstig de fluorescentie kleurstof in aftasteenheid. Optimaliseer de bandbreedtes van de gedetecteerde fluorescentie voor elk kanaal tot het maximum. Record alle acquisities sequentieel aan potentiële cross-talking vermijden. Selecteer de meest geschikte beeldvormende voorwaarden op basis van de fluorescerende kleurstof selectie met behulp van de acquisitie software. Acquire beeld Kaart van een die automatisch wordt gemaakt van het centrum in een spiraalvormig patroon,met het gebied van belang omdat ze gemakkelijk worden geselecteerd voor nader onderzoek. Selecteer observatie modus. Selecteer maximaal vijf soorten observatie modi waaronder time-lapse, Z-stack, en multi-gebied als dat nodig is. Gebruik een combinatie van Z-stack en time-lapse-modi in het huidige onderzoek en vul snel het vastleggen van het beeld, Veranderen en schakel de fluorescente kleurstof. Als alternatief overlay de tl en het licht contrast beelden met elkaar. Observeer live-beeld met behulp van het geselecteerde punt op de linker onderste kaart scherm. Bepaal de beeldvorming gebied met behulp van de framing en zoomen functies. Eventueel schakelen tussen de schermen voor elk type fluorescentie kleurstof. OPMERKING: De microscoop gebruikt in dit protocol heeft dezelfde functionaliteit als een high conventionele confocale in een compact ontwerp. De microscoop is uitgerust met omgekeerde water-immersie doelstellingen die optimaal geschikt zijn voor stabiele time-lapse imaging van levende cellen met een vereenvoudigde ingebouwde incubator. </li> Signaal analyse en kwantificering Gebruik de imaging software om de fluorescentie-signaal te kwantificeren. Verkrijgen van vijf kaartbeelden met de 10X objectief voor zowel geteste monster en mobiele controle. Verkregen 1.024 × 1.024 pixels regelmatig beelden, met een 0,231 um x 0,231 micrometer pixelgrootte. Afbeeldingen opslaan als Olympus Image Format (OIF) voor signaalanalyse. Dit formaat kunt opslaan van verschillende parameterinstellingen en beelden samen. Gebruik verschillende analyse-instrumenten (meten van intensiteit profiel intensiteitsverhouding tussen de twee gebruikte kanalen). Bewaar de maximale projectie beelden als 12 bits / pixel TIFF-bestanden. Voorvormen statistische analyses met behulp van de R commandant software. Analyseer de verschillen met behulp van one-way variantie-analyse (ANOVA) met een herhaling test. Verslag resultaten als gemiddelde standaarddeviatie (± SD) en statistische significantie bij p <0,05.

Representative Results

Figuur 1 toont een overzicht van de Live / Dead gekleurde cellen verkregen in kaartbeelden (10X objectief) voor zowel controle en cellen blootgesteld aan de geteste samengestelde extracten (ELS extra lage krimp). De driedimensionale structuur van de cellen kunnen worden gevisualiseerd aan de vergroting 600X. Visualisatie van cellen in de regelkamer en de cellen in de kamer in aanwezigheid van de geteste samengestelde extracten werden ingezameld is weergegeven in figuur 2. De maximale projectie (60X objectief) toont het lot van geselecteerde celpopulaties bij de start van het tijdsverloop (15 min) en aan het einde van het tijdsverloop (ten 5 uur). Zevenenvijftig stapels afbeeldingen (xyzt mod scan, 39 beelden per stapels voxel diepte 1,00 um) werden verkregen tijdens deze periode. Een lichte vermindering in de groene fluorescentiesignaal en zeer kleine variatie in de rode fluorescente werden verkregen blootgestelde cellen. Geen significante verschillen waargenomen voor controlecellen. Samengestelde extracten blootgestelde cellen aangenomen vergelijkbaar spil morfologie met controle cellen; morfologie niet in deze experimentele omstandigheden gewijzigd (ondanks het groene signaal daling en de rode signaal toename in aanwezigheid van de geteste composiet). Beeldanalyse werd uitgevoerd op vijf verschillende geselecteerde beeld stacks voor de verschillende celpopulaties uit de verkregen beelden van de geteste samenstelling in vergelijking met de negatieve controle cellen voor zowel groen en rood signaal. Het intensiteitprofiel van gekleurde cellen wordt geïllustreerd in figuur 3; de groene en rode signaal evolutie van de cellen in contact met de geteste samenstelling vergelijkbaar met die van controlecellen. Calceïne en EthD-1-emissie-intensiteiten werden gemeten met controlecellen en samengestelde blootgestelde cellen. De meting werd uitgevoerd bij intervallen van een uur tot vijf uur. De groen / rood fluorescentieverhouding (gebaseerd op geïntegreerde intensiteiten van de groene 495-515 nm en rode 620-650 nm signalen) Werd berekend tijdens de time-lapse-periode. De levensvatbaarheid verhoudingen voor controle- en cellen blootgesteld aan ELS extra lage krimp extracten worden getoond in de T abel 1. In aanwezigheid van de geteste samenstelling, het percentage levende cellen bleek weinig afnemen van 100% tot 93,9% na 1 uur contact. Significant verschil waargenomen tussen de geteste composiet en de negatieve controle (cellen zonder enige composiet extracten) na 5 uur van de aangegeven time-lapse periode. Figuur 1: Overzicht image mapping getoonde gekleurde cellen op objectieve 10X, (A) controle cellen en (B) cellen in aanwezigheid van composiet extracten (ELS extra lage krimp) in het begin van de time lapse periode (t = 15 min). Groene gebieden zijn levende cellen en rode gebieden zijn beschadigde cellen. In dezeexperimentele omstandigheden, geen variatie (zowel groene en rode fluorescentie) werd waargenomen voor composieten blootgestelde cellen in vergelijking met de negatieve controle cellen. Figuur 2: CLSM beelden op objectieve 60X van een cel populatie van (A) regelkamer en (B) samengestelde extracten kamer in het begin en het einde van de blootstelling time-lapse periode (I: 15 min en II: 5 uur, respectievelijk ). Groene gebieden zijn levende cellen en rode gebieden zijn beschadigde cellen. Het paneel van de beelden getoond kleine verandering in de intensiteit signaal (lichte daling van het groene signaal en lichte stijging in het rode). Nr celmorfologie veranderingen werden waargenomen in de aanwezigheid van samengestelde extracten; cellen handhaafden hun spoelvormige en fibroblastische morfologie controlecellen bloot. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "always"> Figuur 3: Lijnprofiel cellen waargenomen in time-lapse microscopie (A) Controle cellen (B) samengestelde extracten blootgestelde cellen, (I) 15 min en (II) 5 uur.. Geen zichtbare verandering in het groene signaal ontwikkeling in aanwezigheid van geteste samenstelling ongeacht de tijd contact. Echter, de lichte toename van rode signaal werd waargenomen in de aanwezigheid van composiet na 5 uur van contact. Contact tijd (uur) Levensvatbaarheid van de cellen (%) 1 2 3 4 5 Controlecellen 100 100 100 </Td> 100 100 ELS extra lage krimp ® 93,9 ± 7 91,3 ± 5 * 89,5 ± 3 * 87,6 ± 2 * 87,7 ± 3 * Tabel 1:. Snelheid van levende cellen HGF evolutie na 1, 2, 3, 4 en 5 uur van contact met samengestelde extracten Cel levensvatbaarheid werd bepaald door kleuring met de Live / Dead cytotoxiciteit kit. Gegevens tonen gemiddelde waarden ± SD van vijf beelden stacks analyse. Waarden significant verschillend van de controle cellen bij p <0,05.

Discussion

Biocompatibiliteit materiaal gedrag is de meest vereiste parameter die moet worden geëvalueerd voordat medisch gebruik. Internationale standaarden omvatten medische hulpmiddelen ISO 10993 33 en specifiek tandheelkundige materialen ISO 7405 34. De afwezigheid van de toxische effecten op de omringende cellen is de sleutel norm in de biocompatibiliteit evaluatie van dergelijke materialen. Daarom cytotoxiciteit testen heeft zo'n belang bij de beoordeling van tandheelkundige materialen biocompatibility 35-37. De ISO suggereerde testmethoden kan worden gebaseerd op de metabole activiteit of membraan integriteit. Geselecteerde eindpunten moeten voorwaarden voor het rangschikken bijwerkingen bij testmateriaal om de tijd en de kosten van de beoordeling assays minimaliseren volgen. De huidige methode van onderzoek (3D confocale time lapse imaging) is membraanintegriteit gebaseerd. De cytotoxiciteit evaluatie via dit eindpunt lijkt een waardevolle marker van cel biocompa zijnbaarheid met geteste materialen en het is ook ISO goedgekeurd eindpunt. In vitro testen zijn ontwikkeld om te bepalen hoe een materiaal monster van invloed op een bepaald celtype. De colorimetrische MTT assay werd oorspronkelijk beschreven door Mossman (1983) als een bruikbare methode voor de meting van in vitro cytotoxiciteit en celproliferatie. De MTT test is gebaseerd op de omzetting van het tetrazoliumzout tot formazan kristallen op actieve cellen, die mitochondriale activiteit bepaalt. Dit kan worden vertaald door levensvatbaarheid tarief 38. Gupta en medewerkers meldde dat de MTT test is de meest gebruikte methode voor het meten van cytotoxiciteit van composieten. Barnsteenzuur dehydrogenase en alkalische fosfatase reacties zijn ook gebruikt voor hetzelfde doel 39. Echter, het lot cellen niet worden opgevolgd, aangezien de MTT assay vereist doden van de cellen bij elke meting tijdstip. Om beter te kunnen volgen van het gedrag van de gekleurde cellen in de huidige studie, direct observatie van levende cellen werd uitgevoerd, dankzij de time lapse CLSM imaging gecombineerd met een kort protocol vlekken, geautomatiseerde beeldanalyse en fluorescent signaal kwantificering.

Tandheelkundige composieten komen in nauw contact met orale weefsels, vooral tandvlees en pulpale cellen. 41 – fibroblasten zou het doelwit van componenten vrijgegeven van deze herstellende composieten 40 zijn. Bovendien hebben onderzoeken zien dat geïmmortaliseerde cellen en primaire cellen verschillende cellulaire responsen in contact met biomaterialen kunnen hebben. Primaire cellen bleken beter om biomaterialen effecten 42 te beoordelen. Dit verklaart het gebruik van primaire humane gingivale fibroblasten als celmodel voor cytotoxiciteit beoordeling van de geteste Composiet in de huidige studie. De toxiciteit potentieel van de vrijgekomen stoffen uit Composiet is vaak bestudeerd 43-44. Om t beoordelenhij cytotoxische potentieel van materialen, konden twee contactpunten model cellen worden uitgevoerd. In het directe contact modelsysteem het materiaal direct geplaatst doelcellen terwijl het indirect contactsysteem doelcellen in contact met elueert uit biologische media. In klinische toepassingen en voor restauratieve procedures, worden Composiet geplaatst in indirect contact met de gingiva. Daarom werd de experimentele protocol gericht op het indirect contactsysteem met humane gingivale fibroblasten (cellen in aanwezigheid van de geteste samengestelde extracten). Zoals eerder gemeld door Dahl en medewerkers, werd cytotoxiciteit reacties gerangschikt als ernstig (<30%), matig (30-60%), lichte (60-90%) of niet-cytotoxisch (> 90%) op basis van de activiteit ten opzichte waarden voor de besturing 45. Daarom is het volgens deze rangschikking en in het licht van de bereikte resultaten (tabel 1), composiet ELS extra lage krimp zou kunnen worden gerangschikt als very lichtjes cytotoxische en toonde vergelijkbaar gedrag om cellen te controleren gedurende de gehele time lapse periode. Gebruiken precies dezelfde onderzoeksmethode, kunnen de resultaten van dit onderzoek worden vergeleken met die van een recent gepubliceerde studie. De ELS extra lage krimp composiet een superieure biocompatibiliteit vergelijking met de twee eerder geteste composieten gebruikt voor dezelfde klinische toepassing die direct herstel 11. Verdere studies zijn nog nodig om meer volledige vergelijking te vestigen.

Bij de beslissing welke cytotoxiciteit assay te keuren voor een specifiek eindpunt beoordeling is het noodzakelijk dat de voordelen en de beperkingen van elk assay begrijpen. Het hoofddoel van confocale beeldvorming is een 3-D structuur van cellen en organen bereiken. De techniek kan niet alleen het oppervlak van een monster, maar ook de ondergrond te onthullen. Het hier beschreven protocol onderstreept het gebruik van 3D CLSM time lapse confocale beeldvorming, als een sensitieve methode voor de in vitro biocompatibiliteit gedrag van een Composiet beoordelen. Echter, teneinde de beperkingen die eigen is aan te vermijden, anti-vibratie werkstations kan worden gebruikt om stabielere en langere tijd lapse imaging toestaan; het blad kan het gebruikt confocale systeem isoleren van de nadelige effecten die trillingen in het laboratorium kan veroorzaken. Voorts materialen voor gebruik in de mondholte idealiter onschadelijk voor het gingivale weefsel en dient geen stoffen die systemische toxiciteit kunnen veroorzaken. Overeenkomstig de gebruikte methodologie en de resultaten van de huidige studie resultaten kan worden geconcludeerd dat de geteste samenstelling (ELS extra lage krimp) niet cytotoxisch in de onderhavige experimentele omstandigheden. Zoals de CLSM methode gevoelig kan geven de initiële snelheid van levensvatbare cellen, zouden andere mogelijkheden te voorzien om meer eindpunten evalueren. In het bijzonder als het is onlangs gemeld dat composiet monomeren beïnvloeden cellen thrdoorgedreven reactive oxygen species (ROS) 46- 48, is verder onderzoek nodig is om correlaties te beoordelen of eventuele tussen cytotoxiciteit signalering netwerken en ROS productie. De toekomstige protocol kan worden ontworpen om gelijktijdig te evalueren ROS productie (H 2 O 2 en / of O 2 – vlekken) en cytotoxiciteit verhouding (Live / dode vlekken) met behulp van time-lapse CLSM imaging.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Saremco Dental Switzerland and Olympus Microsystems France Companies are gratefully acknowledged for their financial support. Saremco Dental is also acknowledged for the generous donation of the dental composites ELS extra low shrinkage. The authors also wish to express their appreciation to Dr Simon Banks from the department of Chemistry (University College London) for his assistance with English revision.

Materials

Olympus Fluoview FV10i  Olympus Confocal microscope
O2/Co2 Incubator Pnasonic MCO 5M Cell incubation
Live/Dead® Kit Invitrogen  MP 03224 Stain 
ELS extra low shrinkage®  Saremco  Dental composite
DMEM medium Sigma D 6046 Culture medium
Trypsin Sigma T1426 harvesting cells
chamber slide system   PAA 14220040X Culture chamber
penicillin/streptomycin  PAA P11-010 Cell culture
Amphotericin B PAA P11-001 Cell culture
Foetal bovine serum  PAA A11-101 Cell culture
Cell Counter Merck Millipore 00110230TP1 Cell counting 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Van Landuyt, K. L., et al. How much do resin-based dental materials release? A meta-analytical approach. Dent. Mater. 27 (8), 723-747 (2011).
  2. Moharamzadeh, K., Van Noort, R., Brook, I. M., Scutt, A. M. Cytotoxicity of resin monomers on human gingival fibroblasts and HaCaT keratinocytes. Dent. Mater. 23 (1), 40-44 (2007).
  3. Santerre, J. P., Shajii, L., Leung, B. W. Relation of dental composite formulations to their degradation and the release of hydrolyzed polymeric-resin-derived products. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 12 (2), 136-151 (2001).
  4. Geurtsen, W. Biocompatibility of resin-modified filling materials. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 11 (3), 333-355 (2000).
  5. Hensten-Pettersen, A. Skin and mucosal reactions associated with dental materials. Eur. J. Oral Sci. 106 (2), 707-712 (1998).
  6. Paranjpe, A., Sung, E. C., Cacalano, N. A., Hume, W. R., Jewett, A. N-acetyl cysteine protects pulp cells from resin toxins in vivo. J. Dent. Res. 87 (6), 537-541 (2008).
  7. Falconi, M., Teti, G., Zago, M., Pelotti, S., Breschi, L., Mazzotti, G. Effects of HEMA on type I collagen protein in human gingival fibroblasts. Cell. Biol. Toxicol. 23 (5), 313-322 (2007).
  8. Jontell, M., Hanks, C. T., Bratel, J., Bergenholtz, G. Effects of unpolymerized resin components on the function of accessory cells derived from the rat incisor. 74 (5), 1162-1167 (1995).
  9. Urcan, E., Scherthan, H., Styllou, M., Haertel, U., Hickel, R., Reichl, F. -. X. Induction of DNA double-strand breaks in primary gingival fibroblasts by exposure to dental resin composites. Biomaterials. 31 (8), 2010-2014 (2010).
  10. Sigusch, B. W., et al. Resin-composite cytotoxicity varies with shade and irradiance. 28 (3), 312-319 (2012).
  11. Attik, G. N., Pradelle-Plasse, N., Campos, D., Colon, P., Grosgogeat, B. Toxicity Evaluation of Two Dental Composites: Three-Dimensional Confocal Laser Scanning Microscopy Time-Lapse Imaging of Cell Behavior. Microsc. Microanal. 19, 596-607 (2013).
  12. Ausiello, P., et al. Cytotoxicity of dental resin composites: an in vitro evaluation. J. Appl. Toxicol. 33 (6), 451-457 (2011).
  13. Durner, D., Obermaier, J., Draenert, M., Ilie, N. Correlation of the degree of conversion with the amount of elutable substances in nano-hybrid dental composites. Dent. Mat. 28 (11), 1146-1153 (2013).
  14. Sigusch, B. W., Völpel, A., Braun, I., Uhl, A., Jandt, K. D. Influence of different light curing units on the cytotoxicity of various dental composites. Dent. Mater. 23 (11), 1342-1348 (2007).
  15. Knezevic, A., Zeljezic, D., Kopjar, N., Tarle, Z. Influence of curing mode intensities on cell culture cytotoxicity/genotoxicity. Am. J. Dent. 22 (1), 43-48 (2009).
  16. Krifka, S., Seidenader, C., Hiller, K. -. A., Schmalz, G., Schweikl, H. Oxidative stress and cytotoxicity generated by dental composites in human pulp cells. Clin. Oral Investig. 16 (1), 215-224 (2012).
  17. Harorli, O. -. T., Bayindir, Y. -. Z., Altunkaynak, Z., Tatar, A. Cytotoxic effects of TEGDMA on THP-1 cells in vitro. Med. Oral Patol. Oral Cir. Bucal. 14 (9), 489-493 (2009).
  18. Reichl, F. X., et al. Cytotoxicity of dental composite (co)monomers and the amalgam component Hg(2+) in human gingival fibroblasts. Arch. Toxicol. 80 (8), 465-472 (2006).
  19. Aranha, A. M. F., Giro, E. M. A., Hebling, J., Lessa, F. C. R., Costa, C. A. d. e. S. Effects of light-curing time on the cytotoxicity of a restorative composite resin on odontoblast-like cells. J. Appl. Oral Sci. 18 (5), 461-466 (2010).
  20. Schulz, S. D., König, A., Steinberg, T., Tomakidi, P., Hellwig, E., Polydorou, O. Human gingival keratinocyte response to substances eluted from Silorane composite material reveal impact on cell behavior reflected by RNA levels and induction of apoptosis. Dent. Mater. 28 (8), 135-142 (2012).
  21. Tadin, A., Marovic, D., Galic, N., Kovacic, I., Zeljezic, D. Composite-induced toxicity in human gingival and pulp fibroblast cells. Acta Odontol. Scand. 72 (4), 304-311 (2014).
  22. Schweikl, H., Schmalz, G. Toxicity parameters for cytotoxicity testing of dental materials in two different mammalian cell lines. Eur. J. Oral Sci. 104 (3), 292-299 (1996).
  23. Issa, Y., Watts, D. C., Brunton, P. A., Waters, C. M., Duxbury, A. J. Resin composite monomers alter MTT and LDH activity of human gingival fibroblasts in. 20 (1), 12-20 (2004).
  24. Brambilla, E., Gagliani, M., Ionescu, A., Fadini, L., García-Godoy, F. The influence of light-curing time on the bacterial colonization of resin composite surfaces. 25, 1067-1072 (2009).
  25. Modareszadeh, M. R., et al. Cytotoxicity of set polymer nanocomposite resin root-end filling materials. Int. Endod. J. 44, 154-161 (2011).
  26. Tamilselvam, S., Divyanand, M. J., Neelakantan, P. Biocompatibility of a conventional glass ionomer, ceramic reinforced glass ionomer, giomer and resin composite to fibroblasts: in vitro study. J. Clin Pediatr. Dent. 37 (4), 403-406 (2013).
  27. White, J. G., Amos, W. B., Fordham, M. An evaluation of confocal versus conventional imaging of biological structures by fluorescence light microscopy. J. Cell Biol. 105 (1), 41-48 (1987).
  28. Alpino, P. H. P., Pereira, J. C., Svizero, N. R., Rueggeberg, F. A., Pashley, D. H. Use of fluorescent compounds in assessing bonded resin-based restorations: a literature review. J. Dent. 34 (9), 623-634 (2006).
  29. Chen, Y., Liang, C. -. P., Liu, Y., Fischer, A. H., Parwani, A. V., Pantanowitz, L. Review of advanced imaging techniques. J. Pathol. Inform. 3, 22 (2012).
  30. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced Fluorescence Microscopy Techniques—FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
  31. Stoddart, M. J., Furlong, P. I., Simpson, A., Davies, C. M., Richards, R. G. A comparison of non-radioactive methods for assessing viability in ex vivo cultured cancellous bone: technical note. Eur. Cell Mater. 12, 16-25 (2006).
  32. Louvet, J. N., Attik, G., Dumas, D., Potier, O., Pons, M. N. Simultaneous Gram and viability staining on activated sludge exposed to erythromycin: 3D CLSM time-lapse imaging of bacterial disintegration. Int. J. Hyg. Environ. Health. 214 (6), 470-477 (2011).
  33. . Dentistry – Preclinical evaluation of biocompatibility of medical devices used in dentistry – Test methods for dental materials. International Standards Organization. , (2009).
  34. . Biological evaluation of dental devices. International Standards Organization. , (2009).
  35. Elshahawy, W. M., Watanabe, I., Kramer, P. In vitro cytotoxicity evaluation of elemental ions released from different prosthodontic material. Dent. Mater. 25 (12), 1551-1556 (2009).
  36. Williams, D. F. On the mechanisms of biocompatibility. Biomaterials. 29 (20), 2941-2953 (2008).
  37. Illeperuma, R. P., et al. Immortalized gingival fibroblasts as a cytotoxicity test model for dental materials. J. Mater. Sci. Mater. Med. 23 (3), 753-762 (2012).
  38. Wataha, J. C., Lockwood, P. E., Bouillaguet, S., Noda, M. In vitro biological response to core and flowable dental restorative materials. Dent. Mater. 19 (1), 25-31 (2003).
  39. Ergun, G., Egilmez, F., Yilmaz, S. Effect of reduced exposure times on the cytotoxicity of resin luting cements cured by high-power led. J. Appl. Oral Sci. 19 (3), 286-292 (2011).
  40. Yap, A. U., Han, V. T., Soh, M. S., Siow, K. S. Elution of leachable components from composites after LED and halogen light irradiation. Operative Dentistry. 29 (4), 448-453 (2004).
  41. Lee, S. Y., Greener, E. H., Menis, D. L. Detection of leached moieties from dental composites in fluids stimulating food and. 11 (6), 348-353 (1995).
  42. Anselme, K., Davidson, P., Popa, A. M., Giazzon, M., Liley, M., Ploux, L. The interaction of cells and bacteria with surfaces structured at the nanometre scale. Acta Biomateriala Journa. 6 (10), 3824-3846 (2010).
  43. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  44. Gupta, S. K., Saxena, P., Pant, V. A., Pant, A. B. Release and toxicity of dental resin composite. Toxicol. Int. 19 (3), 225-234 (2012).
  45. Dahl, J. E., Frangou-Polyzois, M. J., Polyzois, G. L. In vitro biocompatibility of denture relining materials. Gerodontology. 23 (1), 17-22 (2006).
  46. Krifka, S., Seidenader, C., Hiller, K. A., Schmalz, G., Schweikl, H. Oxidative stress and cytotoxicity generated by dental composites in human pulp cells. Clin. Oral Investig. 16 (1), 215-224 (2012).
  47. Krifka, S., Spagnuolo, G., Schmalz, G., Schweikl, H. A review of adaptive mechanisms in cell responses towards oxidative stress caused by dental resin monomers. Biomaterials. 34 (19), 4555-4563 (2013).
  48. Chang, M. C., et al. The role of reactive oxygen species and hemeoxygenase-1 expression in the cytotoxicity, cell cycle alteration and apoptosis of dental pulp cells induced by BisGMA. Biomaterials. 31, 8164-8171 (2010).

Tags

Confocal Time-lapse ImagingCytocompatibilityDental CompositesELS Extra Low ShrinkagePrimary Human Gingival FibroblastsLive/Dead StainingFV10i Confocal SystemFV10-ASW 3.1 SoftwareIn Vitro Biocompatibility Assessment

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Attik, G. N., Gritsch, K., Colon, P., Grosgogeat, B. Confocal Time Lapse Imaging as an Efficient Method for the Cytocompatibility Evaluation of Dental Composites. J. Vis. Exp. (93), e51949, doi:10.3791/51949 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image