A alta Ensaio imagem Conteúdo de Identificação da neurotoxina botulínica Inibidores
Summary
Botulinum neurotoxin is one of the most potent toxins among Category-A biothreat agents, yet a post-exposure therapeutic is not available. The high content imaging approach is a powerful methodology for identifying novel inhibitors as it enables multiparameter screening using biologically relevant motor neurons, the primary target of this toxin.
Abstract
Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic neurotransmitter release. Botulinum neurotoxin serotype A (BoNT/A) is a zinc metalloprotease that blocks exocytosis of neurotransmitter by cleaving the SNAP-25 component of the SNARE complex. Currently there are no licensed medicines to treat BoNT/A poisoning after internalization of the toxin by motor neurons. The development of effective therapeutic measures to counter BoNT/A intoxication has been limited, due in part to the lack of robust high-throughput assays for screening small molecule libraries. Here we describe a high content imaging (HCI) assay with utility for identification of BoNT/A inhibitors. Initial optimization efforts focused on improving the reproducibility of inter-plate results across multiple, independent experiments. Automation of immunostaining, image acquisition, and image analysis were found to increase assay consistency and minimize variability while enabling the multiparameter evaluation of experimental compounds in a murine motor neuron system.
Introduction
A bactéria Clostridium botulinum produz neurotoxina botulínica, um dos mais potentes toxinas biológicas conhecidas para o homem 1. Existem 7 sorotipos BoNT distintas (TB / AG). BoNT / A-Gall induzir paralisia na junção neuromuscular, devido à proteólise complexo SNARE 2,3. SNARE proteólise impede-neurotransmissor vesícula de membrana de fusão e, por conseguinte, bloqueia a exocitose do neurotransmissor 4. O alvo SNARE específica depende do serotipo particular, BoNT envolvidos no processo de intoxicação. BoNT / A e BoNT / E se apegam SNAP-25 enquanto que cliva BoNT / C ambos SNAP-25 e syntaxin 5. O restantes serotipos sinaptobrevina clivam (também chamado de proteína de membrana de vesícula-associado (VAMP). BoNT / A foi escolhida para o desenvolvimento do ensaio, uma vez que é responsável por uma proporção elevada de ocorrência natural botulismo e tem a maior duração de acção 6. Desenvolvimento de pequena molécula terapêutica contra BoNT / A é uma meta importante parao nosso programa de descoberta de drogas e utilizou métodos tradicionais à base de alvo para identificar inibidores de sítio proteolíticas activas 7, 8-10. No entanto, a criação de inibidores de sítio activo com actividade de largo espectro contra vários serotipos e eficácia pós-exposição irá provavelmente ser um desafio.
Temos, portanto, implementado uma abordagem inovadora, fenotípicas descoberta droga que usa BoNT SNAP-25 clivagem como um desfecho funcional para identificar pequenas moléculas que podem bloquear BoNT mediada por intoxicação do neurônio motor. SNAP-25 é necessária para a libertação de neurotransmissores, como a degradação de SNAP-25 é preditivo da paralisia e letalidade in vivo. Por exemplo, o rastreio baseado em células poderia levar à descoberta de novos moduladores de factores celulares responsáveis pela inactivação da toxina ou a inibição das vias de toxina no interior das células-alvo. Um fator importante no desenvolvimento de ensaio fenotípico é a seleção de modelos biológicos fisiologicamente relevantes. We e outros descreveram rato estaminais embrionárias (ES) derivadas de células de neurónios motores que recapitulam o carácter imunológico de neurónios motores principais, incluindo a expressão de SNAP-25, 11- 13. É importante notar que estes sistemas celulares são altamente sensíveis a BoNT / A intoxicação e demonstrar a clivagem dependente da dose de SNAP-25 em resposta a concentrações crescentes de toxina 11,12. Os neurónios motores diferenciadas também são produzidos em quantidades que são suficientes para uma análise baseada placa de alto rendimento e permitiram a construção de uma variedade de ensaios celulares.
O ensaio fenotípico é um método de imunofluorescência utilizando dois anticorpos diferentes para quantificar a clivagem de comprimento total endogenamente expressa SNAP-25 durante BoNT / A intoxicação da cultura do rato do neurônio motor. Um terminal carboxilo BoNT / A (BACS) anticorpo sensível à clivagem que reconhece apenas o comprimento total SNAP-25 permite a avaliação de BoNT / A proteólise mediada da SNAP-25expressão no motor de rato neurônios 10. Um diagrama esquemático do ensaio IHC está representado na Figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
A alta potência de neurotoxinas botulínicas e relativa facilidade de seu armamento resultou em sua classificação como Categoria A (prioridade mais alta) agentes biothreat pelos Centros dos EUA para Controle e Prevenção de Doenças. Infelizmente, não há terapias aprovadas pela FDA para contrariar BoNT intoxicação após a toxina tenha sido internalizados pelos neurónios motores. Qualquer mecanismo druggable que promove a recuperação neuronal de BoNT intoxicação pode levar para o desenvolvimento de uma terap…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding was provided by the Joint Science and Technology Office – Chemical Biological Defense (JSTO-CBD) Defense Threat Reduction Agency (DTRA) under sponsor project number CCAR# CB3675 and National Institutes of Health (1 R21 AI101387-01 and 5 U01AI082051-05).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Botulinum neurotoxin A | Metabiologics | NA | No catalog number |
| Microtitre plates | Greiner | 655946 | Poly-D-Lysine 96-well plates |
| BACs antibody | Lampire Biological | NA | |
| Microchem | National | 0255 | |
| Methanol | Thermo Scientific | A412-20 | |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050 | |
| PE JANUS MDT Mini Automated Workstation | Perkin Elmer | AJMDT01 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Triton X 100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| BIII tubulin antibody | R&D Systems | BAM1195 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379-1L | |
| Hoechst 33342dye | Invitrogen | 3570 | |
| Antimouse IgG | Invitrogen | A21236 | |
| Anti rabbit IgG | Invitrogen | A10042 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.4 | |
| Spotfire | Perkin Elmer | Ver 5.5 | |
| Clorox bleach | Fisher Scientific | 18-861-284 | |
| PlateStack |
References
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