Floresan işaretli hücrelerin çoğaltılmış görüntü tabanlı analiz sağlayan esnek bir bilişim iş akışı sundu. iş akışı nükleer ve sitoplazmik belirteçleri rakamlarla ve bu bölmeleri arasındaki işaretleyici translokasyonu hesaplar. Prosedürler 96 oyuklu formatta indirek immunofloresan ile işaret tespiti için siRNA ve güvenilir bir yöntem kullanarak hücrelerin pertürbasyon verilmiştir.
Yapışık memeli doku kültürü modelleri hücrelerin davranışını yöneten kontrol mekanizmalarının anlaşılması gelişmeler tek hücreli analizi modları giderek daha bağımlı hale gelmektedir. Hücre popülasyonlarının gelen biyomarkerların ortalama değerleri yansıtan kompozit verileri teslim Yöntemleri çalışılan biyolojik sistemin heterojen yansıtan ICSI'nin dinamiklerini kaybetme riski. Bu doğrultuda, geleneksel yaklaşımlar yerini ediliyor, ya da yüksek içerik mikroskobu ile değerlendirmesini sağlamak için geliştirilmiştir hücresel tahlil, daha karmaşık formlar ile destekledi. Bu deneyler potansiyel özel yazılım paketleri eşlik tarafından etkin floresan belirteçler, görüntüleri çok sayıda oluşturmak hücre başına çok parametrik ölçümler için izin verir. Bununla birlikte, nispeten yüksek yatırım maliyetleri ve bu cihazların çoğunun aşırı uzmanlaşma birçok araştırmacı için erişilebilir önlemiştir.
Burada tarif a,floresan mikroskobu görüntüleri ile kullanım için uygun olan tek tek hücrelerin özel hücre içi bölgelerde birden fazla floresan markör yoğunluklarının ölçülmesi için evrensel olarak geçerli bir iş akışı. Bu iş akışı Key floresan işaretleyici yoğunluğunu bu görüntüler tek tek hücrelerin, hücre içi tanımlanan bölgelere bölüm ayırt ve teslim serbestçe kullanılabilir Hücre Profiler yazılımı 1 uygulanması bu bölgelere özgü değerler olduğunu. görüntü verileri tek tek hücre yoğunluğu değerlerinin ekstraksiyon bu iş akışının merkezi amacı ve yapışık insan hücrelerinde G1 kontrol noktası düzenleyiciler için bir siRNA ekranından kontrol verilerinin analizi ile izah edilecektir. Bununla birlikte, burada sunulan akışı hücre pertürbasyon diğer araçlarla sağlanan verilerin analizi uygulanabilir (örneğin, bileşik, ekranlar) bu ve floresan bazlı hücresel belirteçlerinin diğer formları ve laboratuarlar arasında geniş bir aralığı için yararlı olacaktır.
Burada sunulan çalışma tek tek hücreler ve belirlenen hücre içi bölgeleri belirlemek için yapışık hücreler floresan mikroskop görüntüleri algoritma güdümlü dökümü yapmak için serbestçe ulaşılabilen yazılımın Celi Profiler kullanımını tarif eder. Bölütlemesi olarak adlandırılır bu yaklaşım, her bir hücre ya da (haliyle bölümlere ayrılmış nesneler adlandırılır) hücre içi bölgesinde lokalize floresan işaretli belirteçleri miktarının tarafından görüntüsü hücrelerin daha sonra çok parametre analizi sağlar. Bu iş akışı, yüksek içerik analizi sağlamak için bir temel oluşturur ve daha gelişmiş ve çok parametrik uyacak şekilde modifiye, bireysel hücre özel yüksek-içerik araçların veya tescilli yazılım erişimi olmayan laboratuvarlarda analizleri edilebilir bir araç olarak hizmet etmek amaçlanmıştır. Bu yazının birlikte verilen dosyalar açıklanan analiz oluşturmak için ilgili ham görüntü verileri, algoritma ayarları ve destekleyici komut bir deney seti bulunmaktadır. verilen algoritma ayarları fveya Hücre Profiler ayarlamak örnek veriler ve ayarlar diğer çalışmalardan görüntü verilerinin kullanılmasını sağlamak için gerekli olabilir ne Tartışma bölümünde detayları için optimize edilmiştir.
Nicel veri Hücre Profiler kullanarak ekstre edildikten sonra, farklı laboratuvarlar ham veri bireysel hücre değerleri tarafından sunulan bilgilerin nasıl kullanılacağı için farklı gereksinimleri olabileceğini; Burada gösterilen girişler her bir deney için ham verilere uygulanan geldiği bir yaklaşımdır. Bu kapıları kullanarak, veri kapıları tarafından tanımlanan yanıtı geçiren hücrelerin alt popülasyonlar farklı tedaviler bağlayan eğilimlerin görselleştirme izin yanıt ikili açısından dönüşür. kapıları ilgili her ölçüm için uygun negatif ve pozitif kontroller için elde edilen verilerin dağılımlarının gözlemlerine dayalı ayarlanır. kapıları kullanımı, ham, hücre bazlı ölçümler yönetmek için nasıl sadece bir örnektir. Ayrıca burada gösterilen nükleer DNA yoğunluğu kullanımı benikapılı veriler ile bir arada değerleri sürekli bir dizi olarak, ham formunda asurements. Görüntü analiz verileri yönetmek Diğer yaklaşımlar çalışmanın niteliğine bağlı olarak, dikkate alınmalıdır; alt popülasyonlar hücreleri atanması için kapılarını kullanarak istatistiksel alternatifler parametrelerin çok sayıda 3 bildirilmiştir genelinde yüksek içerik verileri özetlemek için stratejiler 2 ve sistematik karşılaştırmalar bildirilmiştir.
6 – Görüntü verilerinin yüksek içerik analizleri ilaç yanıtının hücresel çalışmalarda kullanılmasını bulduk, genetik ve çevresel stres sinyalizasyon 4 ters. yüksek içerik analizi hak floresan mikroskop verilerinin analizi algoritmik nicel ve mekansal parametreler tek tek hücrelerin 7 genelinde eş zamanlı olarak dikkate alınması izin vermesinden kaynaklanıyor. Bu şekilde, birçok tahlil için hücresel sonuçları analiz: d çapraz referans diferansiyel davranış olabilirefined hücre alt popülasyonlar morfolojik değişkenlerin dikkate içerebilir deneysel koşullar ve tahlillerde izlenebilir. stratejileri ve analiz iş akışı diğer yüksek-içerik yaklaşımlar gibi, bireysel hücrelere çapraz başvurulan çoğaltılmış veri sunma yeteneğine sahiptir, burada ele. Floresan mikroskop görüntüleri oluşturmak ve binlerce görüntü kadar düşük kapasiteli geleneksel floresan tabanlı mikroskopi üretilen görüntülerin onlarca arasında değişen verilerin analizi için geçerli olan Yüksek içerik yöntemleri takım çalışmalar otomatik yüksek içerik tarama platformları kullanarak üretti.
akışı ayrı deneyler nükleer floresan markörü şiddet ya da sırasıyla, bir flüoresan raportör proteininin çekirdek / sitoplazmik translokasyon ya bakımından ölçüldüğü, örnek veri ile burada gösterilmiştir. iş akışı, bu deneyler, ayrı ayrı olarak ya da kombinasyon halinde EAC bağlı olması ile esnekh farklı araştırmacılar tarafından araştırma sorusunu verilen. örnek, veri RNA interferans (RNAi), deney (Şekil 1) bir parçası olarak üretilmektedir. Susturucu RNA oligonükleotidleri (siRNA), sikline bağımlı kinaz (CDK) aktivitesinin iki floresan haberci için değişikliklere neden HCT116 insan kolorektal karsinom hücrelerinde spesifik proteinlerin demonte etmek için kullanılır. Serin nükleer retinoblastoma 780 (p-S780 RB1) olarak CDK6-bağımlı fosfatlamanın antikor lekelemesi yoluyla değerlendirilir. Aynı hücrelerde, CDK2 aktivitesi (GFP CDK2 raportör) yeşil floresan protein etiketli raportör CDK2 etkinliğinin olmaması raportör çekirdekten sitoplazmaya ve CDK2 aktivasyon servisleri üzerinde bulunan sitoplazmik oranı nükleer değerlendirilir 8. Buna ek olarak, her bir hücrenin nükleer DNA, bir DNA-ara boya kullanılarak lekelenmektedir, görüntüler çekirdek sınırları hücreleri belirlenmesi ve tanımlanması için bir araç olarak hizmet eder bisbenzimid, hem de birDNA, bolluk hücrenin hücre döngüsü durumuyla ilgili bilgileri sağlayan (Şekil 2) sa ölçer.
CDK6 ve CDK2 faaliyetleri hücre döngüsünün 5 S fazına G1 hücre geçiş tespit edilebilir ve bu, tek tek hücrelerin iki muhabir arasında yakın bir uyum beklendiği gibi, birbirine 9,10 başarılı ve. Burada kullanılan gösterim veri kümesi siRNA etkisi CDK6, retinoblastom proteini (RB1) ve bir hedefleme negatif kontrol (Tablo 1) hedef bir örnek olarak analiz eder. CDK6 demonte p-S780 RB1 epitopunun bir azalmaya ve hücre döngüsünün G1 fazında hücrelerin birikmesi hem ortaya çıkarmak gerekir. RB1 Knockdown fosfo-S780 antikorunun özgünlük için bir reaktif kontrolü olarak hizmet vermektedir. Formalin floresan mikroskop görüntüleri floresan lekeli HCT116 doku kültürü hücreleri, algoritmik görüntü analizi için kullanılan, 11 sabit. Elde edilen sayısal veriler için kullanılançapraz-referans muhabirleri ve farklı demonte devletlerin etkisini ölçmek.
Bu tür bir analiz tarafından üretilen verilerin potansiyel büyüklüğü normal analiz araçları bir meydan okuma sunabilir. Örneğin, bireysel hücre veri bazı elektronik tablo yazılımı karşılayacak daha büyük olabilir. Büyük veri setleri analizi yardımcı veri basit, yüksek tekrarlayıcı, denetimli işleme gerçekleştirmek Perl scriptleri dahildir. Perl script Belirli bir dosya adlandırma kuralı (Şekil 3) ile görüntü dosyalarını işlerken Hücre Profiler tarafından üretilen çıktı dosyaları için özel olarak yazılmış, ve analiz kullanılmak üzere kuyu başına alanların değişken numaralar için izin verir. Bu hücre alt 5 trendleri izlemek için kapı bireysel hücre deneyi verilerine sık önemlidir ve burada gösterilen her tahlil türü için önceden belirlenmiş bir dizi kapısı dayalı her hücre bayrak bir Perl script kullanımıdır. Da dahil isteğe Perl komut vardırhangi bireysel kuyuların (veya koşullar) veri sonuçlarını özetlemek, teslim: set kapısı içindeki hücrelerin ve ham tahlil puanları ortalama değerlerin yüzdesi. yanıtları tamamını veya bir kuyu içindeki hücrelerin çoğunluğunu etkileyen durumlarda veri görüntüleme ikinci, daha homojen şekilde geçerlidir. Yukarıda ele alındığı gibi, bu gibi değerlendirme yanıt olarak bir popülasyon içindeki hücrelerinin bir alt kümesi ile sınırlı tek tek hücre veri gating ile elde daha az kullanışlıdır.
açıklanan iş akışı programı siRNA veya tarif işaretleyici deneyleri ile pertürbasyondan sınırlı değildir. Çalışmalar siRNA kombinasyonu, kimyasal inhibitörleri ve radyasyon tedavisi ile doku kültürü deneyleri ve CDK6 dışındaki belirteçler ve CDK2 aktivitesi 5 değerlendirilmesi için yanıtları analiz etmek için, bu yaklaşımı kullanmışlardır.
Kavramsal olarak, deneysel strateji biyolojik kullanışlı hücre içi bölgelerde çeşitli otomatik kayıt sağlarfloresan mikroskop görüntüleri mevcut olan tek tek hücrelerde. Gibi, bu yaklaşım nüfus ziyade bireysel hücreler üzerinde odaklanmak teknikleri ile atlanabilir nicel, çoğaltılmış veri ortaya biyolojik bilgiyi elde edebilirsiniz. Küçük modifikasyonlar ile tarif edilen bir yaklaşım ve analiz akışı bir floresans bazlı deney çıkışları ve hücre-biyolojik yanıtlar, kantitatif, tek tek hücre veriler sağlayabilir burada DNA içeriğinin nicel değerlendirme, çekirdek ya da sitoplazmik floresan ölçümü ya da bunların arasındaki belirteçlerin mekik İki bölme, ya tek tek ya da bir çok katlı bir şekilde ilgi çekmektedir. Yayınlama gereksinimleri artan bir şekilde yayınlanmış verileri yeniden analiz isteyen laboratuvarlar da doğrudan ilgilendiren olacak burada anlatılanlar gibi açıkça erişilebilir ham verilere erişimi ve mikroskopi görüntü analizi için ücretsiz araçlarımızdan ile aşinalık sunulması doğru eğilimi gibi.
tarif akışı siRNA, daha sonra etiket algılama kullanarak hücrelerin çukurlu bir perturbance için bir yöntem teşkil eder ve son olarak elde edilen floresan mikroskobu görüntülerinden sayısal verilerin çıkarılmasını kolaylaştırmak için yazılım destekli bir dizi aşama kullanımı. yaklaşım, birçok hücre tabanlı uygulamalarda geniş pratik uygulama vardır tek tek hücrelerin nükleer ve sitoplazmik yoğunluk değerlerinin teslim, odaklanmıştır. Burada kullanılan örnek, veri G1 fazındaki hücre döngüsü geçiş için iki floresan deneyleri test edilmiş ve geri nükleer DNA içeriğinin daha doğrudan bir biyofiziksel ölçüye ilişkili olan bir siRNA ekran ortamda elde edilmiştir.
bireysel hücrelerin belirlenmesini sağlar ve ortaya çıkan 'Çekirdekler maske' ilgili cytoplasmi tanımlamak için başlangıç noktası olarak hizmet gibi görüntü nükleer DNA'ya bir floresan DNA leke kullanımı, görüntü segmentasyonu sürecinde vazgeçilmez bir adımdırC bölgeleri. Kararlı biçimde hücrelerde ifade edilir GFP etiketli CDK2 raportör, ancak bu bölme tarif edilebilir tarafından sitoplazma içerisinde arka plan sinyali sürekli olarak daha yüksek bir değişken verir. Aynı analiz boru hattı için diğer uygun floresan bağlanmış habercilerin ve perturbance tepkilerini kullanılarak protein translokasyon olayların analizi için geçerli olmalıdır. Ayrıca, sitoplazma özel floresan boyalar ile GFP-CDK2 muhabiri ikame bu algoritmanın alternatif kullanım sitoplazmasında boyutlarını ve görüntüleri hücrelerin göreceli boyutlarını ölçmek için izin verecek.
Burada anlatılan görüntü segmentasyonu stratejisi başka tasarım dikkate DNA ölçümü için entegre yoğunluk değerlerini sunmak için Hücre Profiler kullanılmasıdır. Yoğunluk Entegrasyon boyama verileri nukleus boyutunda olası varyasyonlar için izin nükleer DNA için değerleri ve görülen miktar profilleri için yakın bir maç temsiliçin, propidyum iyodür lekeli FACS verileri. Bununla birlikte, Entegre edilen yoğunluk, antijen floresans ortalama yoğunluğu ile örneklenen ortalama konsantrasyon, daha fazla biyolojik olarak, bir hücre bölmesi içinde protein (ve ilgili floresan) entegre toplam miktarına göre uygun olduğu proteinin fonksiyonunu değerlendirmek için uygun bir araç sağlar olmayabilir. Bu nedenle yoğunluk değerleri P-S780 RB1 ve GFP verileri kullanılmıştır anlamına gelir. seçeneği Hücre Profiler yazılımı 'ExportToSpreadsheet' panelinde bulunan iki mod (ortalama veya entegre) veri değerlendirme arasında değiştirmek için.
3_channels_pipeline.cppipe dosyasındaki analiz ayarları örnek veri setinde görüntüler için optimize edilmiştir. Bu protokol ile yeni görüntüler setleri analizi dosya adları adlandırma kuralı yukarıda (Şekil 3) tarif kabul gerektirecektir. Ayrıca, duyarlılık arka nükleer DNA boyama ve eşik parlaklığını uygun değerleriYeni görüntü setleri şiddetler Hücre Profiler ayarları içinde ayarlanması gerekebilir. DNA boyama çeşitli görüntü segmentasyonu maskeleri oluşturmak için geçerlidir kilit rolü göz önüne alındığında, bu kanal için doğru hassasiyet ayarları uygulama Hücre Profiler yazılımı ile yeni görüntü verilerinin analizine başarılı anahtarıdır. sağlanan Hücre Profiler ayarları dosyası (3_channels_pipeline.cppipe) yeni verilere analizi uyarlanması için en sık yararlı parametreler üzerine notlar içermektedir. Bu notlar Hücre Profiler ana penceresinde ekranın üst kısmındaki metin kutusuna ve hassasiyet ayarlarını değiştirme ve kanal sayısı analiz edilecek ayarlama konusunda rehberlik dahildir. Yeni görüntü verileri ayarlarını test etmek Protokol bölümünde 2.8, olarak suçlanan gibi (Şekil s1d '… belirleyin Nesneler' her biri için 'göz' simgeleri açık tıklayarak protokol adımlarını görüntü analizi sırasında görüntü segmentasyonu gözlemlemek için gerekli olabilir </strong>). Çekirdekler maske doğru bir DNA boyama görüntülerden tespit edilirse, özellikle, 'IdentifyPrimaryOjects' üzerinden görüntü veri görselleştirme gösterir. 'IdentifyPrimaryOjects' modülü için Hücre Profiler yazılımı sayfasında eşik düzeltme faktörüdür. Bu değerin Deneme ve hata düzeltmesi en nükleer tanıma hataları düzeltmek olacaktır. değerleri her görüntü için arka plan yoğunluğu karşı DNA kanalı denge. Eşik düzeltme faktörü değerleri bu daha büyük daha (net görüntüler için iyi) sıkı ve az 1 hoşgörülü (boyama ve arka plan arasındaki kontrast daha az olan görüntülere uygun) olduğunu 1, etrafında menteşe.
Hücre Profiler bireysel hücre veri ham çıktı, diğer çalışmaların ihtiyaçlarını karşılamak için çeşitli şekillerde analiz edilebilir. Burada gösterilen veriler biyolojik eğilimleri ayıklanması yardımcı olmak amacıyla hücre başına ölçülen parametrelerin iki kapılarını uygulamak için bir Perl script kullanımıEk ölçümlerle belirlenen alt popülasyonlar d izni çapraz referans. O Hücre Profiler çerçevesinde yolluk unsurları içerir eşit mümkün olsa da, burada kullanılan alternatif rota büyük veri setleri değerlendirilmesi gerekir, özellikle eğer, daha fazla esneklik ve hız sağlar. Mevcut protokol sonrası görüntü elde etme aşamalarında yavaş sahne Hücre Profiler yazılımı çalışan olduğunu. Gerekirse Hücre profil burada farklı kapı değerleri ile iteratif, daha hızlı sonraki Perl script ile tekrar analiz edilebilir bir un-kapılı ham veri seti üretmek için kapıları empoze olmadan çalıştırmak ve. Tüm çalışmalar bu gibi uygun kapı değerleri potansiyel zamanla herhangi bir veri kümesi verilen üzerinde reaktif ile değişebilir önceden bilecek. Dolayısıyla, uygun bir kapı valu belirlemek için pozitif bir kontrol ve sahte tedirgin hücreleri için hücre Profiler elde edilen ham veri dağılımı gösteren histogramlar oluşturmak için önerilirilgi parametrelerinin es.
Perl script Hücre Profiler veri değişmez bir sütun yapısını kabul yazılır ve bir kullanıcı 'ExportToSpreadsheet' ayarlarını kullanarak Hücre Profiler ile parametreler çıkış sayısını değiştirir eğer durmasına olabilir. Notlar Perl komut dosyaları içinde yer alan ayarları değişiklik uygulamak yardımcı olmak. Bu bir metin editörü komut görüntülemek görmek için, tercihen bir programcı metin editörü (örneğin, http://www.activestate.com/komodo-edit) renk kodu Perl elemanları ayarlanır. Veri formatında değişikliklere uyum için komut dosyası ayarlamak için nereye Bu notlar gösterir. Perl script benzer, görüntü analiz verilerinden rakamlar komplo için talimatlar içeren sağlanan Ar-kod dosyası (analysis.r), kullanım ve adaptasyon ek notlar görmek için bir metin editörü veya RStudio yazılımında okunabilir. Bu notlar düzenli ifadeler ve Perl <ayrıntıları ile takviye edilebilirsup> 12 ve veri okuma açıklamalı ve sırasıyla, çizilen nasıl temelini oluşturan her ikisi de R için ggplot2 13 paket.
Floresan mikroskobu kullanarak yeni çalışmalar yanı sıra açık kaynak yayınlar tevdi ham veriler, burada tarif edilen analiz yöntemleri ile tedavi edilebilir. yüksek içerik verilerinin doğası herhangi bir gözlemci araştırma çıkarlarına bağlı olarak farklı analitik vurguları ile özyinelemeli analiz için oldukça rahat. Veri istenebilir sorular başlangıçta kullanılan prob ile sınırlı olmasına rağmen, görüntü verileri genellikle anlamlı onları üretilen çalışmaların kapsamı dışında tekrar analiz edilebilir.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma hibe CRUK 15.043 ve 14.251 CRUK tarafından desteklenmiştir.
Biz teknik yardım ve yazının eleştirel okuma Daniel Wetterskog ve Ka Kei Ho teşekkür ederim.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
AllStars negative control siRNA | Qiagen | 1027280 | Negative control siRNA. |
CDK6 siRNA | Dharmacon/ Custom synthesis | NA | Antisense sequence: 5' CUCUAGGCCAGUCUUCUUCUU |
RB1 siRNA | Dharmacon/ Custom synthesis | NA | Antisense sequence: 5' GGUUCAACUACGCGUGUAATT |
5x siRNA buffer | Thermo Scientific | B-002000-UB-100 | To be diluted with nuclease-free, non-DEPC treated water. |
Nulcease-free water (non-DEPC) | Applied Biosystems | AM9937 | For dilution of siRNA buffer. |
Hiperfect | Qiagen | 301705 | Transfection lipid. |
DMEM | Life Technologies | 41966052 | Pyruvate and high-glucose supplemented tissue culture media. |
96 well tissue culture plate | Falcon | 3072 | Plain, 96-well tissue culture plate for the parallel, compartmentalized mixing of transfection complexes. |
Packard Viewplate | Perkin Elmer LAS | 6005182 | 96 well TC plate with optical base on which cells are transfected, grown, fixed and eventually imaged. Supplied with opaque, adhesive plate seals, which are used during storage of used plates. |
Breathable membrane | Alpha Labs | LW2783 | Sterile, gas-permeable, adhesive membrane. |
Neutral buffered formalin, 10% | Sigma-Aldrich | HT5012-1CS | 10% Formalin (4% formaldehyde) fixative used neat in protocol. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100PC | Non-ionic detergent |
Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | Trizma base (tris(hydroxymethyl)aminomethane) |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | For plate wash solution. |
Anti-P-S780 RB1 antibody | Abcam | ab32513 | Rabbit monoclonal |
AlexaFluor647 Anti-rabbit | Invitrogen | A21245 | Highly cross-adsorbed, fluorescently labelled secondary antibody. |
Hoechst 33342 (Bisbenzimide) | Sigma-Aldrich | B2261 | Fluorescent, chromatin-intercalating, DNA dye. |
Permeabilization solution | NA | NA | 0.1% Triton X-100 in 50 mM Tris-buffered saline, pH 8.0. |
Plate wash solution | NA | NA | Tris-buffered saline containing 0.1 % Tween-20. |
Block solution | NA | NA | 5% powdered milk in Tris-buffered saline and 0.1% Tween-20. For blocking plate prior to immuno-staining and dilution of antibodies. |
Cell Profiler 2.1 | Broad Institute | http://www.cellprofiler.org/download.shtml | |
Active Perl Community Edition | ActiveState | http://www.activestate.com/activeperl/downloads | |
R programming environment | The R Foundation | http://www.r-project.org | |
Rstudio | Rstudio | http://www.rstudio.com/ |