人类癫痫术后皮层组织的多电极阵列录音

注：这里所描述的协议遵循法国的“法国精品行业Consultatif国家科特迪瓦Ethique”的指导方针，并宣布由INSERM一个征集活动。 1.手术切除癫痫人体组织患者取得患者难治性癫痫患脑组织。手术前获得书面知情同意书。 对于所有操作的癫痫患者进行了广泛的手术前的后处理，包括神经系统检查，神经心理学评估，表面脑电图和神经影像（MRI和有时18 FDG-PET扫描的; 图1A），接着切除的组织的外科手术后的组织学检查（ 图1B） 。注：手术中指出，当不同的探索本地化类似的发作起始区，当其去除的好处超过了手术风险。 手术麦ntain抗癫痫药物预操作性。与吸入七氟醚（6％递送率和100％的吸入的O 2分），静脉内舒芬太尼（0.3微克/千克）和antracurium（0.5毫克/千克），接着用静脉内舒芬太尼维修感应：在全身麻醉下进行手术（0.5微克/千克/小时）和吸入七氟醚（1，MAC）。 使用神经导航系统，以允许在受损皮层（ 图1C）的精确定位。后的皮肤切口，执行中的骨随后用高洒钻头开颅钻孔内。轻轻地提升骨瓣，然后打开用剪刀（ 图1D）硬脑膜。 使用术中超声，以便在手术显微镜下识别的异常皮层，和显微器械和超声波抽吸。 凝结和根据脑沟限制切断的PIO-蛛网膜平面。使用软膜下剥离至Release来自各地的受损区域的软皮质。 切正常皮质下白质完成一件“整块”切除术，不遗余力，尽可能的血管。避免创伤性操作的皮质。 切成1厘米厚的片出了切除的组织的沿一个方向正交的软膜表面，包括沟底部及过渡皮质。 2.人工脑脊液（学联）的切片准备，孵化和录音学联的切片准备制备1升的蔗糖为基础的ACSF 7,8，含有（以mM计）：250蔗糖，3的KCl，25的NaHCO 3，10 D-葡萄糖，1的CaCl 2，10的MgCl 2;溶解这些盐在去离子水和充氧与卡波金的溶液至少10分钟。 放〜700毫升蔗糖的ACSF中，在-80℃下进行50-60分钟（或-150℃下进行15-20分钟）。不断的休息根据氧合冰的解决方案。注：ACSF中为片制剂可贮存于4℃;在这种情况下，加在实验的CaCl 2和MgCl 2的那一天，将其冷却之前。 学联的切片孵化和录音准备至少3L的记录的ACSF 7,8的，它含有（以mM计）：124氯化钠，氯化钾3，26的NaHCO 3，10 D-葡萄糖，1.6的CaCl 2，1.3 MgCl 2的;溶解这些盐在去离子水和充氧与卡波金的溶液。在添加氯化镁 ，保留一些学联在0 镁离子学联进行录音。注：孵化/记录的ACSF可贮存于4℃;在这种情况下，添加的CaCl 2和MgCl 2的实验的日子。 3.设备切片孵化和录音接口室孵化片采用脑片室维持生活片体外</ em>的接口模式。注：该腔室是由一低部，其中包含了加热和传感元件和一个陶瓷鼓泡器，并填充有蒸馏水，和上部，其中，所述片上休息晶状体组织中的平坦区域的片材中的腔室的中心（ 图2A – B）中 。 使用两个单独的细的PTFE管中，通过该preoxygenated ACSF进入腔室。注：将管螺旋中被加热的水并到达腔室的上部;然后将溶液排出通过毛细作用带镜头薄纸，该输送溶液进入出口孔装置。 连接接口室的聚四氟乙烯管，以蠕动泵，以允许与preoxygenated介质的切片的连续灌注。 由通过陶瓷扩散器与卡波金（95％O 2和5％CO 2）的充氧维持高氧张力。注：此温热和湿润的混合气体达到片在通过适当的孔腔的上部。 通过将腔室与温度控制器，通过一个特殊的双端连接线，具有连接器，用于所述腔室的加热元件和一个外部温度传感器的一端保持在所述腔室的上部的温度。在附近放置切片传感器在整个温育（ 图2C）检查温度。 多电极阵列记录使用平面多电极阵列120的氮化钛电极（直径30微米）绝缘用氮化硅和内部参比电极，布置在一个12×12的矩阵与200μm的中心到中心的间距。注意：用不同的电极直径和间距的其它配置是可能的。特别是，在MEA芯片可以加宽来样较大的人体组织的切片。 获得的电信号在10kHz使用MEA2100-120系统（前和音响滤波器放大器，通过专用的软件（MC_Rack）集成的数据采集和模拟 – 数字转换器，16位的数据的分辨率，输入电压范围和带宽，通过软件可调）。注：MEA2100探头被赋予一个金属板，通过磁持有人可加热灌注元素固定的，在整个录制过程持续灌注切片。 持组织向下在MEA由小自制铂锚，这确保了片和电极之间有良好的电耦合。 4.编写界面商会和工具解剖和切片接口室装满蒸馏水的界面室的下段。确保水的水平完全沉浸在加热元件和为2至4mm的腔室的下部和上部部分之间的连接处下方。在加热开关前，每天都要检查这个层面上，为了避免加热元件的损害。 该腔室连接到一个卡波金源，赋予了二次流量调节器对气体压力进行微调。 切镜头纸的片材，以适合的堰板腔的平坦区域，并且其定位接近输入解管，让来自输入线路的任何气泡逃逸到达片之前。 切两片滞留棉线的，只要片透镜的组织，并将它们沿腔的平坦区域的主面的位置。注意：这有助于略微提高腔室中的灌注溶液的水平。 设置蠕动泵的流速为1毫升/分钟，并启动泵。 启动水的氧合作用在腔室的底部部分。 将温度控制器的温度在37℃，并打开它。盖上一片封口膜的界面室的上部，并等待至少30分钟的Temperat .. [温度URE增加和稳定。 工具解剖和切片准备解剖套件包括两个细镊子，铲子，一个小勺子和一个刀片;两个玻璃培养皿中，两个电刷以及氰基丙烯酸酯胶。 设置的vibratome的参数：厚度400微米;频率，70 – 90赫兹;振幅，0.9 – 1毫米，速度：0.1毫米/秒。 5.人力皮质切片制备取下-80℃冷冻蔗糖为基础的学联，混匀，以获得一种搪塑的。与卡波含氧它，把〜250毫升玻璃瓶，并保持它在杜瓦瓶中装满冰块，而要去医院的手术室，以获得组织。在此期间，保持静止，在-20℃下。 注：在手术中，神经外科医生解剖皮层组织的一小块。立即放入冰冷的蔗糖学联样品转移到实验室。 保持所需要的从医院转移到实验室到最多30分钟的时间。在实验室中，以蔗糖为基础的含氧学联出​​-20℃的冰箱中，混合它有行贿，填补了培养皿和的vibratome缓冲盘，并同时启动与卡波充氧。小心取出一块人体组织从瓶中，用勺子，把它的皮氏培养皿（ 图2D）。 使用镊子，小心地取出血栓，血管及脑膜，避免切割过程中的阻力。除去脑膜，包括在软质，从组织块的侧面开始，注意不要损伤大脑皮质表面。用刀片，切割组织，以获得平坦的表面，这将在对标本的vibratome板胶合的一侧。注：脑膜，包括在软质，除去来自组织块的侧面开始，注意不要损伤大脑皮质表面。 如果TI块ssue大于MEA的腔室，在样品板（ 图2E）胶合之前切下一块的相应尺寸。 胶组织，以获得横向皮质切片，放入缓冲盘切400微米厚的薄片，在低速（0.1毫米/秒）（ 图2F）。 镜头切与组织切片维度件;用刮铲和刷子，传送片上，这些透镜的组织和开始记录（ 图2G – I）的前孵育它们在接口室中于37℃下至少1小时。连续地存储在相同的条件下的切片，直到使用。注：对镜头纸放置片是为了便于片底侧的两个灌注和从接口室切片的记录前除去的重要步骤。 在传送片的镜头纸，管理起来非常仔细，避免与触摸皮质层区域刷。 制备切片一次一个，并立即他们每个传送到接口室，以确保适当的氧气供应和温度尽可能快地切片切除组织的块。 6.准备MEA设置为录音堵塞灌注系统以蠕动泵与MEA系统到计算机。含氧录音学联。将放大器内部的空MEA芯片。 设置温度控制器，用于加热套管元件达到37℃，在MEA室并开始灌注在5-6毫升/分钟。注意：通常是必要的，设置温度3-4℃，比所述一个需要的话，根据房间温度和流率。 检查在MEA室内的温度用细温度计，将其放置在尽可能接近该中心，而不触及电极面积。 开始录制仿真软件e和检查所有的MEA的电极连接好，并且有因灌注无噪音。 开始MEA_Monitor检查摄像机表的功能。 7.转移切片从界面室以MEA芯片记录倒一些温热的玻璃培养皿记录的ACSF;用钳子，采取从接口室切片，通过镜头的组织抓住它，并把它放在培养皿。仔细分离从组织切片。如果在接口室中的溶液的水平期间的温育时间是经过精心调节，限幅将分离从镜头纸浸没它在溶液中;否则，用一个小刷子，方便拆卸。 填充的MEA芯片与一些ACSF和用抹刀，切片转移到它。用塑料巴斯德吸管，轻轻地取下的解决方案，使切片粘附在电极区域，并与铂ANCH保持它在的地方或。加入1 ml录音学联，将MEA芯片进入放大器，并在5-6毫升/分钟开始灌注（ 图2J – L）。 检查在MEA记录区域中的切片位置使用MEA_Monitor，如果需要调整它，以便从所述皮质层来记录并拍照。开始录制。