Killer artificiale cellule presentanti l'antigene (KaAPC) per una efficiente<em> In Vitro</em> L'esaurimento delle Umana antigene-specifiche cellule T

1 Generazione di HLA-A2-Ig Based KaAPC Preparare tampone borato sterile. Fare una soluzione 0,1 M di acido borico in acqua e regolare il pH a 7,0. Filtro sterile (0,22 micron) tampone e conservare a 4 ° C. Preparare sterile tampone di lavaggio tallone. Utilizzare tampone fosfato salino (PBS) senza magnesio e calcio. Aggiungi siero AB umano per concentrazione finale del 3%. Aggiungi etilendiamminotetraacetico (EDTA) per 2 mM di concentrazione finale. Aggiungi sodio azide (NaN 3) per la concentrazione finale 0,01%. Filtro sterile (0,22 micron) tampone e conservare a 4 ° C. Trasferire 250 ml di perline epossidici (circa 100 x 10 6 perline) a magazzino in una sterile, con tappo a vite fiala di vetro. Aggiungere 250 ml di tampone borato. Mettere fiala di vetro su un magnete e lasciate perline aderire per 2 min; tampone aspirare e rimuovere flaconcino di vetro da magnete. Lavare perline una volta con 1 ml di tampone borato. Risospendere le sfere in 550 ml di 0.018 mcg/ Ml HLA-A2-Ig e 3.64 mg / ml di anti-umano CD95 monoclonale (clone CH11) e mescolare delicatamente agitando. (Si prega di consultare la sezione di discussione per ulteriori informazioni.) Incubare fiala di vetro su una estremità rotatore sopra fine, a 4 ° C per 24 ore. Spin down perline a 300 xg per 2 minuti. Posizionare flaconcino di vetro su un magnete per 2 minuti e aspirare la "soluzione di carico KaAPC"; rimuovere fiala di vetro da magnete, aggiungere 1 ml di tampone di lavaggio tallone e risospendere accuratamente agitando. Ripetere il punto 1.10 due volte. Incubare fiala di vetro su un rotore a 4 ° C per 24 ore in 1 ml di tampone di lavaggio tallone. A questo punto, tutti i siti di legame con le proteine ​​residue sarà bloccato da siero AB umano contenute nel tampone di lavaggio tallone. Spin down perline a 300 xg per 2 minuti. Luogo ampolla di vetro su una calamita per 2 min e tampone di aspirare tallone di lavaggio; rimuovere fiala di vetro da magnete e sostituire soluzione di 1 ml di PBS. 2 Controllo di qualità, Peptide Loading, Wincenerimento, conservazione e la stabilità di KaAPC Trasferire 1,5 x 10 5 KaAPC in un tubo FACS e lavare con 1 ml FACS tampone di lavaggio. Risospendere le sfere in 100 ml FACS tampone di lavaggio e aggiungere 1 ml di anti-topo IgG1 PE (per il rilevamento della parte Fc di HLA-A2-Ig) e 1 ml di anti-topo IgM FITC (clone R6-60.2, per il rilevamento del CD95 mAb anti-umano). Incubare per 15 min a 4 ° C, lavare con 1 ml FACS tampone di lavaggio, e risospendere in 250 microlitri FACS tampone di lavaggio e leggere macchie mediante citometria a flusso. Figura 1 QC macchia di un lotto KaAPC realizzata come indicato nella sezione del protocollo. Colorazione è stata eseguita come descritto nella sezione 2 del protocollo HLA-A2-Ig è stato rilevato utilizzando un anti-topo-IgG1 PE mAb, mentre anti-umano-CD95 (anti-Fas) è stata rilevata con un anti-mouse FITC IgM monoclonale (vedi protocollo section 2.2) (linea blu). Grafici nero pieno rappresentano perle vuoti colorati con anti-topo-IgG1 PE mAb o anti-topo-IgM FITC mAb, rispettivamente. I numeri in alto a destra indicano l'intensità di fluorescenza media (MFI). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Per peptide trasferimento di carico 20 x 10 6 KaAPC in un nuovo flacone di vetro sterile, collocare su una calamita per 2 minuti, aspirare PBS e risospendere le perline in 500 microlitri PBS fresco con 5 mcg peptide (Tenete a mente, solo peptidi HLA-A2 ristretti volontà impegnare sul dimero!). Conservare caricato KaAPC a 4 ° C fino al momento dell'uso, per almeno 3 giorni per consentire sufficiente peptide carico sul dimero HLA-A2-Ig. Immediatamente prima dell'uso, lavare il peptide caricata KaAPC come indicato in 1.14; ripetere questo passaggio almeno 6x. NOTA: Questo è un passo fondamentale per assicurare che il peptide libero ha to essere completamente rimosso per evitare falsi risultati positivi di sterminio; residua peptide libero ha dimostrato di indurre apoptosi in antigene-specifiche colture di cellule T 9. Per escludere un effetto peptide solubile, eseguire campioni di controllo surnatante di peptide caricato e lavato KaAPC (vedi 3.8). Conte perline utilizzando emocitometro e l'etichetta con la data, il nome del peptide e la concentrazione. NOTA: Loaded KaAPC resta funzionale a 4 ° C per almeno un mese. Dopo un mese, ri-caricamento con lo stesso peptide permette KaAPC per essere utilizzato per un massimo di un anno. 3. KaAPC In Vitro Assay Uccidere Preparare co-coltura. Preparare mezzo completo RPMI supplementato con 3% T fattore di crescita delle cellule (made in laboratorio 6) e il 3% dei donatori di plasma autologo. Se il donatore di plasma autologo non è disponibile, utilizzare siero umano AB inattivato al calore. Preparare AnnexinV vincolante preparazione del buffer. Sciogliere 8,12 g di cloruro di sodio (NaCl) e 0,12 g calccloruro ium (CaCl 2) in 990 ml di DDH 2 O.Add 10 ml di tampone di 1M HEPES. Generazione di cellule T antigene-specifiche umani. (Per un protocollo dettagliato consultare una pubblicazione precedente 7 artificiali utilizzando cellule presentanti l'antigene (AAPC)). Assicurarsi che la specificità peptide è almeno> 75% come determinato dal tetramero colorazione. Per ogni campione incubare 2 x 10 5 cellule T antigene-specifiche / pozzetto (in una piastra inferiore 96 ben rotondo) in 200 ml di mezzo di co-coltura in un rapporto 1: 1 con KaAPC per 48 ore in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% di CO 2. Campioni di raccolta e trasferire in una provetta FACS; lavare con 1 ml AnnexinV binding buffer, centrifugare a 300 xg per 5 minuti, scartare il surnatante e risospendere in 100 ml di AnnexinV binding buffer Campioni macchia con 1 ml AnnexinV FITC e 5 microlitri 7-AAD per 10-15 min a RT, lavare con 1 ml di AnnexinV binding buffer; spin down a 300 xg per 5 minuti, scartare il surnatante und risospendere in 250 microlitri AnnexinV binding buffer Leggi i campioni immediatamente al citofluorimetro. Preparare i seguenti campioni per determinare uccisione antigene-specifica da KaAPC: solo le cellule T; Cellule T + solubili anti-CD95; Cellule T + scaricati KaAPC; Cellule T + peptide non-cognate caricato KaAPC; Cellule T + peptide cognate caricato KaAPC; Cellule T + surnatante del peptide cognate caricato KaAPC. . Figura 2 KaAPC test uccidendo Peptide caricato KaAPC o sfere di controllo (solo HLA-A2-Ig perline) sono state coltivate per 48 ore in un rapporto 1: 1 con le cellule CMVpp65 specifici T (~ 80%), raccolte e successivamente tinto con AnnexinV e ioduro di propidio (PI) per determinare l'apoptosi mediante citometria di flusso (vedi sezione protocollo 3,3-3,7). "parente" si riferisce a microsfere caricate con CMVpp65 e "non-cognate" di essereAnnunci carichi di Mart-1 peptide. I numeri indicano la percentuale di cellule T vitali nel quadrante in basso a sinistra di ogni trama. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Per eseguire Intersecato-esperimenti, generare cellule T antigene-specifiche delle due specificità diverse. Ulteriori valutare le capacità di deplezione-antigene-specifiche di KaAPC con una analisi simultanea di eliminazione antigene-specifica delle cellule T nella popolazione di cellule T eterogenea. (Per un protocollo dettagliato si veda Schütz et al. 10).