Neurônios olfativos obtida através Nasal Biópsia Combinada com Laser-Capture Microdissection: Uma Abordagem Potencial para tratamento estudo Response em Transtornos Mentais

O transtorno bipolar (TB) é uma doença neuropsiquiátrica grave, caracterizada por alterações patológicas do humor, conduzir e cognição ^1. Lítio utilizada para o tratamento de BD tem sido mostrado para alterar os níveis de mRNA de estado estacionário de um grande número de genes em estudos com animais ^2, mas continua a ser desconhecida, se qualquer destas moléculas está associada com a resposta clínica em seres humanos ^2. Compreender o mecanismo de resposta de lítio exigiria investigar alterações moleculares induzidas por lítio em tecidos neuronais. Infelizmente, não é prático para a obtenção de biópsias do cérebro de pacientes com TB pré e pós-terapia de lítio para identificar assinaturas moleculares de resposta de lítio. Tecidos cerebrais pós-morte foram usados ​​para estudar biomarcadores em BD, no entanto, eles não podem ser usados ​​para avaliar marcadores moleculares associados com mudanças dinâmicas na emoções, cognição e dirigir; e a validade do retrospectivamente apurado resposta ao tratamento de lítio pode ser problemático ⁴. Os linfócitos e outras células do sangue pode ser útil, mas as mudanças moleculares nas células do sangue podem não refletir alterações neuronal ^3-5. O líquido cefalorraquidiano pode ser insuficiente para obter informações sobre as moléculas intracelulares que podem refletir mudanças intrínsecas associados à doença e medicação reversível.

O epitélio olfatório (OE) é uma parte única do sistema nervoso central (SNC), relacionada com a embryologically de estruturas límbicas ^6; e é facilmente acessível através de biópsias nasais. É constituída por glial-células como células de suporte (ou seja, sustentaculares), basais em proliferação e neurónios dos receptores olfactivos em diferentes fases de desenvolvimento ^7-9. Portanto, OE oferece uma oportunidade única para estudar acessível mudanças dinâmicas no SNC de pacientes com doenças neuropsiquiátricas ^7. Estudos demonstram a utilidade do OE como um substituto do tecido para investigar acontecimentos de doença associados que reflectem aquelas occurring nos neurônios do cérebro ^8,9. Por exemplo, estudos têm utilizado OE para investigar os perfis moleculares associados com condições psiquiátricas ^10-14. Olfactiva sistema também serve para identificar endophenoytpes clínicos, tais como défices cheiro que estão associados com sintomas negativos da esquizofrenia ^15. Além disso, os processos de desenvolvimento neurológico continuar no OE ao longo da vida, fornecendo um caminho útil para modelar a fisiopatologia subjacente de condições psiquiátricas ^8,9.

No entanto, uma desvantagem da utilização deste tecido é a contaminação substancial de biópsias olfactivos com células não-neuronais ^16. Por exemplo, o RNA total usado para estudos de expressão de genes em estudos anteriores OE continha RNA extraído de todo o tecido biopsiado nasal incluindo ARN a partir de células não-neuronais ^17. Portanto, abordagens anteriores têm sido limitados pela qualidade das células. Para superar esse problema, uma nova abordagem para obter populações de células neuronais enriquecido por combinando biópsias nasais com captura a laser microdissection (LCM) foi desenvolvido ^18.

LCM é uma técnica que permite o isolamento selectivo de células usando corte por laser combinado com UV de infra-vermelho do laser ^19-21. Combinando LCM com OE abordagem minimiza a contaminação substancial de OE por células não-neuronais, aumentando assim o enriquecimento de células neuronais ^18. Além disso, a camada neuronal pode ser distinguida a partir da submucosa, sob um microscópio, eliminando assim a necessidade de coloração. Tipos de células neuronais pode ainda ser distinguida de outras populações de células, utilizando anticorpos primários que são expressas pelo tipo celular de interesse ^7. Por conseguinte, este procedimento estabelece um método mais fácil para o enriquecimento da população de células quase puramente neuronal que pode ser utilizada para estudos de expressão de genes, imuno-histoquímica e outras investigações morfológicas.

ve_content "> Este estudo visa estabelecer uma plataforma experimental para investigar as alterações moleculares em neurônios olfativos associadas a estados de doença e resposta ao tratamento. Para resolver isso, um pequeno grupo de pacientes não-fumantes, que preencheram os critérios diagnósticos do DSM-IV para BD baseado em Entrevista Diagnóstica para Estudos Genéticos (DIG) ²² foi recrutado para passar por duas biópsias nasais: uma biópsia pré-tratamento com lítio e a segunda biópsia, após 6 semanas de tratamento com lítio oral diária Além disso, os pacientes com TB elegíveis devem ser:. sintomático para a depressão , com base na pontuação ≥10 de 60 em o clínico administrado Montgomery-Asberg Rating Scale (MADRS) ^23; sintomática de hipomania ou mania, baseado em uma pontuação ≥10 de 56 sobre o clínico administrado Young-Mania Rating Scale (YMRS) ^24;. ≥10 ou em ambos MADRS e YMRS coeficiente Rater-Inter-Rater de acordo entre os clínicos para ambas as escalas é> 0,96 Depois de biópsias, os neurônios foram enri.ched do OE por LCM. Na sequência das medidas adicionais de controle de qualidade, para garantir a extração de RNA de alta qualidade a partir do tecido e enriquecimento neuronal, Tempo real RT PCR foi realizado para investigar os níveis pré e pós-tratamento de expressão de genes de interesse. As seções seguintes, conter uma descrição da validação desta abordagem, com destaque para a otimização do protocolo e as estratégias que foram aplicadas para o protocolo de resolução de problemas.