Verbeterde In-gel Reductive β-eliminatie voor Comprehensive O-gebonden en Sulfo-glycomics door massaspectrometrie

Glycosylering een essentieel eiwit post-translationele modificatie, bijdraagt ​​tot organismale fysiologie, pathologie weefsel en cellulaire herkenning ^1-3. Ondanks de grote vooruitgang in de analytische glycoscience, het karakteriseren van de volledige diversiteit van glycanen op een specifiek eiwit blijft een zeer uitdagende taak, vooral op eiwitten geïsoleerd uit primaire biologische bronnen. Niettemin, de microheterogeniteit van glycoproteïne glycanen vaak invloed functionele interacties met andere eiwitten. Daarom karakterisering van glycan diversiteit is essentieel voor het begrijpen van de fysiologische betekenis van cellen en weefsels glycosylering ^4,5. Om de bijdrage van glycoproteïne glycosylering om weefsel fysiologie en pathofysiologie, robuuste, gevoelige, en uitgebreide glycomic analytische technieken begrijpen steeds belangrijker geworden. In proteoomanalyses worden eiwitidentificaties algemeen bereikt door LC-MS/ MS analyse van tryptische peptiden ^6. Eiwitvertering kan worden uitgevoerd met een gezuiverd eiwit of eiwitten gescheiden door SDS-PAGE na in-gel digestie met proteasen zoals trypsine ^7-9. Voorverrijking van het eiwitmengsel door SDS-PAGE verhoogt de diepte en nauwkeurigheid eiwit ID. De ontwikkeling van analoge strategieën voor glycomic analyse van glycoproteïne glycosylering ligt in de voorhoede van glycoscience.

De twee belangrijkste klassen van glycanen worden door ofwel N-koppeling of O-koppeling aan eiwitskeletten bevestigd. N-gekoppelde glycanen zijn aan asparagine (Asn) residuen die als onderdeel van een sequon gedefinieerd als Asn-X-Ser / Thr / Cys (X elk aminozuur behalve proline), en kan worden vrijgemaakt door enzymatische digestie met peptide N -glycanase (PNGaseF of A), hetzij in oplossing, in-gel of blot op ^10-12. O-gekoppelde glycanen zijn voornamelijk aan serine (Ser) of threonine (Thr) residuen. Echter, slechts één enzym is idenvaardigd dat kan vrijgeven O-gekoppelde glycanen van glycoproteïne en het heeft een zeer beperkt glycan specificiteit vrijgeven alleen de eenvoudige O-gekoppelde glycanen. Chemische releasestrategieën blijven voorkeursmethode voor uitgebreide afgifte van O-gekoppelde glycanen van glycoproteïnen. Reducerende of niet-reducerende β-eliminatie of hydrazinolyse goed gekarakteriseerde chemische afgifte technieken en zijn de meest gebruikte methoden voor het vrijgeven van O-gekoppelde glycanen van glycoproteïnen ^13,14. Hoewel reductieve β-eliminatie is gebruikt om O-gekoppelde glycanen bevrijden van glycoproteïnen door SDS-PAGE, eerdere benaderingen nodig HPLC scheiding voor daaropvolgende analyse ^15-17.

Multidimensional MS (MS ⁿ⁾ analyse verschaft momenteel de rijkste bron van structurele gegevens voor het karakteriseren glycanen afgegeven uit glycoproteïnen die het verwachte meeste biologische bronnen bedragen. De diepte van MSgebaseerde structuurkarakterisering wordt aanzienlijk vergemakkelijkt door permethylating de vrijgekomen glycanen vóór de analyse. Permethylation verbetert ionisatie en heeft de neiging om molaire signaal reacties te egaliseren over een breed scala van glycaanstructuren ^18,19. Bovendien permethylation ondubbelzinnig labels terminal en monosaccharide eenheden met kenmerkende massa, waardoor structuuropheldering ^20-23 verhogen. Bijvoorbeeld zure glycanen algemeen moeilijk te detecteren niet gepermethyleerd species MS. Hoewel zure glycanen negatieve ion modus kan worden gedetecteerd door MS, is het onmogelijk om zowel zure als neutrale glycanen detecteren in dezelfde ionenmodus. Een groot voordeel van glycan permethylation is dat alle vrije hydroxylgroepen (OH) op monosaccharide substituenten een glycan zal worden afgesloten met een methylgroep _(OCH3 of OMe), dus een gesialyleerde glycaan de kosten geneutraliseerd, waardoor ze detecteerbare als gepermethyleerd neutraal (aziëlo) glycanen. De hydroxylgroepen van sulfaat groepen op sulfoglycans zijn bestand tegen permethylation, waardoor retentie van anionische lading, die ionisatie onderdrukt en vermindert gevoeligheid. Deze onderdrukking voorkomt nog glycomic uitgebreide analyse van zeer complexe glycoproteïnen zoals mucinen, die een grote dichtheid aan gesulfateerde ^24-26 glycanen dragen.

Recente rapporten over de zuiverende gesulfateerde glycanen gebruikte gebracht, omgekeerde fase chromatografie te zuiveren en aparte gepermethyleerd glycanen voorafgaand aan MALDI-analyse. Deze werkwijze berust op volledige scheiding van gesulfateerde en niet-gesulfateerde glycanen met verschillende mobiele fasen voor elutie, die we hebben gevonden minder stringent dan organische fase verdeling zijn. Daarom zijn nieuwe technieken geschikt voor de detectie en verrijking van sulfoglycans hier gepresenteerd. Deze technieken zorgen voor de kwantitatieve herstel van gesulfateerde glycanen in de waterfase volgende water: DCM (dichloormethaan)extractie, die routinematig wordt uitgevoerd aan het einde van glycan permethylation ²⁷ reacties. Belangrijk is dat deze robuuste scheiding van gepermethyleerd sulfoglycans uit een mengsel van gepermethyleerd niet-gesulfateerde glycanen gelijktijdig verrijkt voor geladen deeltjes, terwijl ook de vereenvoudiging van MS ² fragmentatiepatronen. Een uitgebreide protocol voor betere in-gel-O-gelinkte glycan analyse wordt gepresenteerd. De verbeterde protocol verbetert glycan herstel, verhoogt de structurele informatie verkregen door middel van MS ⁿ analyse van gepermethyleerd glycanen, en verbetert de gevoeligheid van toepassing op essentiële glycoproteïnen geïsoleerd uit biologische bronnen sulfoglycomic analyses.

Dit protocol is bedoeld voor O-gekoppelde glycan analyse van hele glycoproteïne extracten of een specifiek glycoproteïne van belang opgelost door SDS-PAGE en bestaat uit drie experimentele procedures; A) gel clean-up, B) in-gel reductieve β-eliminatie, en C) glycan permethyning. Het doel is om omvangrijke O-gekoppelde glycomic gegevens te verkrijgen voor glycoproteïnen geoogst uit primaire bronnen van biologisch belang (figuur 1). Glycoproteïnen door SDS-PAGE worden gevisualiseerd door kleuring en banden van belang worden uitgesneden en de resulterende gel band wordt gesneden in kleine stukjes. De gel stukken worden ontkleurd en onderworpen aan ethylacetaat wassen gel verontreinigingen (Figuur 2A) verwijderd. Glycaan afgifte wordt bereikt door in-gel reductieve β-eliminatie (Figuur 2B) en de vrijgekomen glycanen gepermethyleerd. Waterige organische extractie volgende permethylation kwantitatief partities de anionische gesulfateerde glycanen weg van niet-gesulfateerde neutraal glycanen (figuur 2C). In-gel reductieve β-eliminatie gekoppeld waterige organische extractie maakt de karakterisering van O-gekoppelde glycanen en sulfoglycans bezit van kleine hoeveelheden glycoproteïne door SDS-PAGE. Het strategisch overzicht is summarized in figuur 1 en de details zijn weergegeven in figuur 2. Bovendien kan een gedeelte van de gel ontkleurd en gewassen stukken worden gebruikt door standaard eiwit ID LC-MS / MS-proteomica.