Summary
हृदय myocytes में, ट्यूबलर झिल्ली संरचनाओं intracellular नेटवर्क के रूप में. हम गुणवत्ता नियंत्रण, राज्य के अत्याधुनिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए द्वितीय) लाइव सेल धुंधला सहित माउस दिल से myocytes की मैं) अलगाव के लिए प्रोटोकॉल अनुकूलित वर्णन है, और iii) प्रत्यक्ष छवि विश्लेषण घटक जटिलता और intracellular झिल्ली के plasticity यों नेटवर्क.
Introduction
स्वस्थ धारीदार मांसपेशी कोशिकाओं में, मुख्य सेल अक्ष को सीधा "अनुप्रस्थ" झुकाव (टी tubules) के साथ ट्यूबलर झिल्ली संरचनाओं प्रचुर मात्रा में हैं. नतीजतन, टी tubules गहरा सेल केंद्र की ओर cytosol घुसना जो पेशी सेल मुख्य "पार्श्व" सतह झिल्ली (sarcolemma) का निरंतर विस्तार के रूप में लक्षण वर्णन किया गया है. बाहरी सतह झिल्ली के साथ निरंतर टी नलिकाओं के शारीरिक भूमिका वोल्टेज सक्रिय एल प्रकार सीए की nanometric निकटता युग्मन द्वारा अपेक्षाकृत बड़े हृदय की मांसपेशी कोशिका मात्रा भर एसईआर organelle संपर्क डोमेन द्वारा गठित दूरस्थ intracellular डिब्बों का तेजी से बिजली युग्मन है 2 + चैनल आसन्न ryanodine रिसेप्टर (RyR2) एसईआर Ca 2 रिलीज को सक्रिय वर्तमान (मैं सीए) आवक (Cav1.2). Junctional एसईआर डोमेन और टी के बीच निलय myocytes (वी एम एस), गैर निरंतर झिल्ली संपर्क ("जंक्शनों") में-tubules प्रत्येक सेल में 1 व्यक्ति intracellular सीए 2 + रिहाई nanodomains के हजारों नियंत्रित करने के लिए लगा रहे हैं.
किसी भी संपर्क डोमेन के लिए, juxtaposed झिल्ली अंश टी छोटी नली और परिधीय (junctional) सेवा के प्रत्येक दूसरे के करीब 15 एनएम, इसलिए nanodomain के रूप में परिभाषित लगभग हैं. इस प्रकार, बहुत छोटे व्यक्तिगत cytoplasmic subspaces अर्ध सेल स्वायत्त डिब्बे व्यवहार जो सक्षम अलग कर रहे हैं. एक आने वाली संभावित कार्रवाई वी एम एस, एक अपेक्षाकृत छोटे सीए की टी नलिकाओं में Cav1.2 चैनल को सक्रिय करता है जब 2 + आवक वर्तमान तेजी attoliter आकार nanodomain 1 में subspace सीए 2 + एकाग्रता [2 Ca +] एस वृद्धि होगी. अगला, [2 Ca +] एस वृद्धि 2 + -gated ryanodine रिसेप्टर्स (RyR2) juxtaposed एसईआर झिल्ली जंक्शन में नैनोमीटर निकटता के भीतर सीए को सक्रिय करता है, और इस युग्मन प्रक्रिया सभी विद्युत युगल भर में होता हैडी myocyte nanodomains. RyR2s 5-10 RyR2 चैनल 2 के लिए 1 Cav1.2 चैनल के एक अनुमान के अनुसार stoichiometry साथ ही घने मल्टी चैनल समूहों होते हैं. एसईआर करने वाली cytosol के बाद [सीए 2 +] ढाल बहुत खड़ी (अनुपात 10 4: 1) और RyR2s कार्यात्मक युग्मित समूहों में के रूप में उच्च प्रवाहकत्त्व सीए 2 + रिहाई चैनलों समारोह, एक मात्रात्मक बड़े CA में RyR2 सक्रियण परिणाम 2 + 1-2 मिसे 3,4 के भीतर 100 माइक्रोन या इससे अधिक के लिए [2 Ca +] एस स्थानीय subspace बढ़ती टी छोटी नली युग्मित junctional एसईआर डोमेन से मौजूदा रिलीज. यह हृदय संकेत प्रवर्धन व्यवहार भी सीए 2 + रिलीज (CICR) प्रेरित 2 + सीए के रूप में जाना जाता है. साथ में ले ली, टी tubules तेजी से उत्तेजना-संकुचन (ईसी) युग्मन के दौरान junctional nanodomain एसईआर संपर्क और सेल चौड़ा CICR के माध्यम से सीए 2 + रिहाई संकेतों को सक्रिय कि आवश्यक झिल्ली संरचनाओं हैं.
टी नलिकाओं के अलावा, अक्षीय छोटी नलीमुख्य (अनुदैर्ध्य) सेल अक्ष के लिए एक काफी अलग अभिविन्यास समानांतर के साथ एस (ए नलिकाओं) इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम), confocal और 2 फोटॉन माइक्रोस्कोपी पढ़ाई से प्रलेखित किया गया है. उदाहरण के लिए, sarcomere जेड लाइनों के पास टी नलिकाओं के साथ जुड़े myofibrils के बीच एक नलिकाओं की एक सेल चौड़ा निरंतर जाली कोशिकी tracers और तय गिनी पिग वी एम एस 5 के ईएम इमेजिंग द्वारा दिखाया गया था. बाह्य dextran से जुड़े fluorescein धुंधला का उपयोग और चूहे वी एम एस के 2 फोटॉन इमेजिंग रहते हैं, एक जटिल जालीदार 3 डी छोटी नली नेटवर्क ~ 60% टी tubules और ~ 40% ए नलिकाओं 6 से मिलकर कल्पना की गई थी. यह अध्ययन केवल लेकिन यह भी ईएम दृश्य के लिए सेक्शनिंग स्वाभाविक अनुप्रस्थ-अक्षीय छोटी नली प्रणाली (TATS) जैसे जटिल और गतिशील झिल्ली नेटवर्क के विश्लेषण के लिए सीमित है कि वसूली के लिए प्रचुर मात्रा में एक नलिकाओं की 3 डी दृश्य के लिए नेतृत्व नहीं. नतीजतन, TATS झिल्ली की confocal लाइव सेल इमेजिंग सीधे साथ दाग डि-8-ANNEPS विकसित किया गया था. यदि जीवित कोशिकाTATS नेटवर्क फूरियर परिवर्तन से विश्लेषण कर रहे हैं, sarcomere जेड लाइनों के पास अंतरिक्ष में टी छोटी नली घटकों की नियमित उपस्थिति धारीदार संकेतों 7 के एक क्षेत्र से कलाकारों की टुकड़ी शक्ति स्पेक्ट्रम से परिलक्षित होता है. यह अप्रत्यक्ष विश्लेषण रणनीति रोग मॉडल 7 में TATS घटक नियमितता में सेल चौड़ा क्षेत्रीय परिवर्तन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है. उदाहरण के लिए, shRNA मध्यस्थता junctophilin -2 तोड़े नीचे दिल की विफलता और isoform विशिष्ट प्रोटीन की कमी nanodomain सीए 2 + रिहाई शिथिलता 8 के साथ टी छोटी नली पुनर्गठन के परिणामस्वरूप का कारण बना. हमने हाल ही में प्रत्यक्ष मात्रात्मक दृष्टिकोण के माध्यम से और आगे प्रेरित उत्सर्जन रिक्तीकरण (STED) nanoscopy 9 का उपयोग माउस वी एम एस में व्यक्तिगत TATS घटकों का जीना सेल superresolution माइक्रोस्कोपी द्वारा TATS झिल्ली नेटवर्क का विश्लेषण बढ़ाया है. अनुप्रस्थ के 50:50 वितरण अनुमानित जो छोटे व्यक्ति TATS घटकों के प्रत्यक्ष विश्लेषण, के लिए अनुमति दी nanometric छवि संकल्पअक्षीय छोटी नली झुकाव बनाम, मात्रात्मक स्वस्थ माउस दिलों 9 में दो प्रचुर मात्रा में अभी तक विभिन्न उन्मुख व्यक्ति TATS घटकों की पुष्टि. इन रणनीतियों आगे नीचे प्रोटोकॉल अनुभाग में उल्लिखित किया जाएगा.
वयस्क दिल में प्रचुर मात्रा में एक छोटी नली घटकों के शारीरिक भूमिका रहस्यमय बनी हुई है, जबकि ईएम पढ़ाई 2 + अंतर्जात सीए गिनी पिग और चूहे वी एम एस 5,10 में रिलीज nanodomains सुझाव ए नलिकाओं के साथ जुड़े एसईआर झिल्ली संरचनाओं दस्तावेज है. Cav1.2 और RyR2 की Confocal विश्लेषण एक छोटी नली जंक्शनों 10 पर colocalization के एक उच्च स्तर पाया. वी एम एस टी tubules आम तौर पर पाए जाते हैं, जहां जेड लाइन स्त्रिअतिओन्स से अपेक्षाकृत दूर उत्पन्न चूहे में सहज सीए 2 + स्पार्क्स के ~ 20% के बाद से, एक तर्क एक छोटी नली जुड़े nanodomains वास्तव में अस्तित्व है और समारोह हो सकता है कि कर दिया गया है सीए 2 + रिहाई साइटों के रूप में 11,12. दिलचस्प है, टी छोटी नली गठन और परिपक्वता OCजन्म के बाद ही curs और पी -5 में अग्रदूत sarcolemmal invaginations के अंकुरण के माध्यम से जैसे हृदय कोशिकाओं के विकास, समानताएं और अपरिपक्व चूहों 13 में P10 पर TATS नेटवर्क विधानसभाओं branched. यह Junctophilin -2 shRNA तोड़े नीचे के बाद प्रसव के बाद TATS नेटवर्क परिपक्वता के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है देरी सीए 2 + रिहाई और में अपरिपक्व एक छोटी नली प्रभुत्व आर्किटेक्चर के साथ संगत रोग TATS संगठन के प्रमुख के लिए एसईआर जंक्शनों को टी छोटी नली झिल्ली एंकरिंग रोका प्रतीत होता है कि वी एम एस 13. इन टिप्पणियों अंत में सबूत की अवधारणा टी tubules अतिरिक्त या यहां तक कि वैकल्पिक intracellular तंत्र 14 के माध्यम से रूप हो सकता है एक नलिकाओं जबकि झिल्ली invagination प्रक्रियाओं के माध्यम से है कि फार्म के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
हृदय रोग में TATS झिल्ली परिवर्तन की विशेषता pathophysiological प्रश्नों के लिए एक महत्वपूर्ण अनुसंधान के क्षेत्र बन गया है. पेसिंग प्रेरित दिल failu के एक कुत्ते के मॉडल में प्रारंभिक रिपोर्टोंपुन टी tubules और Cav1.2 वर्तमान (मैं सीए) 15 का नुकसान दिखाया. इस्कीमिक कार्डियोमायोपैथी के एक पिग मॉडल टी छोटी नली घनत्व कम दिखाया और intracellular सीए का एक कम synchrony 16 रिलीज 2 +. दिल की विफलता का एक अनायास उच्च रक्तचाप से ग्रस्त चूहा (SHR) मॉडल का उपयोग करना, टी नलिकाओं का नुकसान "orphaning RyR2" की प्रस्तावित तंत्र द्वारा Cav1.2 और RyR2 की कम nanodomain युग्मन के साथ जुड़े थे 7. टी नलिकाओं का नुकसान भी, इस्कीमिक फैली हुई है, और hypertrophic cardiomyopathy नमूने 17 से मानव वी एम एस में दिखाया गया है. इसके अलावा, एक नलिकाओं में वृद्धि मानव फैली हुई cardiomyopathy 18 के ऊतक वर्गों में सूचना मिली थी. रोधगलन के बाद, हम एक छोटी नली घटकों 9 की वृद्धि के विपरीत टी नलिकाओं की महत्वपूर्ण घटने के साथ माउस वी एम एस में TATS पुनर्गठन की एक अंतर तंत्र दिखाया. महत्वपूर्ण बात है, सुधार स्थानीय झिल्ली विपरीत लाइव सेल superre के माध्यम से हासिल कीसमाधान STED माइक्रोस्कोपी समग्र TATS नेटवर्क की लंबाई की बढ़ जाती है और जटिलता 9 शाखाओं के साथ एक नलिकाओं की महत्वपूर्ण प्रसार दिखाया जो प्रत्यक्ष माप, के माध्यम से विस्तृत मात्रात्मक घटक विश्लेषण सक्षम होना चाहिए. इसके अलावा, यह रोधगलन 19 के बाद और हृदय resynchronization चिकित्सा आलिंद tachypacing प्रेरित दिल की विफलता के साथ 20 कुत्तों में टी नलिकाओं के पुनर्गठन को उल्टा करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं कि चूहों में टी छोटी नली remodeling रिवर्स सकता है कि व्यायाम प्रशिक्षण दिखाया गया था. प्रोटोकॉल में उल्लिखित और नीचे वर्गों परिणामों के रूप में साथ में ले ली, रोगग्रस्त मानव और पशुओं के वी एम एस के साथ ही संभावित उपचारात्मक उपायों में दोनों अध्ययनों यकीनन उच्च गुणवत्ता सेल अलगाव प्रक्रियाओं और विस्तृत मात्रात्मक विश्लेषण रणनीतियों से लाभ होगा.
KATP चैनल की TATS झिल्ली तस्करी 21 isoforms बनाम पार्श्व सतह से हाल ही में प्रदर्शन के रूप में इसके अलावा, यह आलिंद मीटर पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण हैyocytes जैविक रूप से अलग करने के साथ ही वी एम एस बनाम तुलनात्मक हृदय सेल मॉडल के रूप में (एम्स). टी tubules हाल ही में भेड़ और मानव एम्स के 22 में दर्ज किया गया. वर्तमान सबूत कुछ टी tubules छोटे कृन्तकों 23 में भेड़ और मनुष्य, लेकिन नहीं की तरह बड़ा स्तनधारियों में आमतौर पर पूर्वाह्न कोशिकाओं में मौजूद हैं और पता चलता है कि. वी एम एस के विपरीत, एम्स में intracellular Ca 2 रिलीज 2 + चिह्नित स्थानिक और लौकिक सीए में यह परिणाम 23 gradients जो सेल केंद्र की ओर प्रसार से कोशिका की सतह प्रचार से घटित होता है. इस ढांचे के भीतर यह ऐसी अलिंद 24 के रूप में intracellular सीए 2 + आम रोग रूपों के लिए अस्थिरता के संकेत के तंत्र को स्पष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण लगता है. संक्षेप में, स्वस्थ और रोगग्रस्त दिल के लिए दोनों AM और वी एम सेल अलगाव और प्रत्येक सामान्यतः प्रोटोकॉल कार्यरत हैं. पर्याप्त सेल गुणवत्ता का सूक्ष्म प्रलेखन द्वारा न्याय के रूप में सेल अलगाव ठीक से किया जाता है, तभी AM और वीएम नमूने सीए होना चाहिएमात्रात्मक TATS विश्लेषण के लिए आगे rried. तदनुसार, निम्नलिखित प्रोटोकॉल वर्गों माउस या बरकरार TATS झिल्ली का विश्लेषण करने के लिए लाइव सेल माइक्रोस्कोपी द्वारा पीछा अन्य प्रजातियों से आइसोलेट्स उच्च गुणवत्ता सेल पर गंभीर रूप से निर्भर हैं. पहले कहा, TATS झिल्ली के लक्षण वर्णन निर्धारण और तैयारी कलाकृतियों 6, आसमाटिक परिवर्तन के कारण झिल्ली में बदलाव, और पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी 9 का संकल्प सीमाओं के लिए एक प्रवृत्ति के साथ एक चुनौतीपूर्ण अनुसंधान क्षेत्र है. हम सीए 2 + इमेजिंग और पैच दबाना के लिए और सेल संस्कृति के लिए चूहे वी एम एस के मानव एम्स के अलगाव के लिए हाल ही में राज्य के अत्याधुनिक प्रोटोकॉल पहले इस पत्रिका 25,26 में प्रकाशित किया गया है कि ध्यान दें.
Protocol
नोट: सभी पशु प्रक्रियाओं की समीक्षा की और प्रयोगशाला पशुओं की मानवीय देखभाल और उपयोग के अनुपालन में यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर Goettingen के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया.
माउस दिल से आलिंद और निलय myocytes की 1 अलगाव
- के रूप में धीरे संभव के रूप में पशुओं को संभालने और अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार पृथक हृदय कोशिकाओं पर neurohormonal ज्यादतियों से संभावित शक्तिशाली अनजाने प्रभाव से बचने के लिए विशेष रूप से सामान्य रूप में तनाव को कम करने के लिए. इसके अलावा, हेपरिन (500 आइयू / किग्रा शरीर के वजन SC) काफी अलगाव के दौरान हृदय कोशिकाओं की उपज और अखंडता समझौता कर सकते हैं, जो रक्त के थक्के और सूक्ष्म एम्बोली को रोकने के लिए पहले दिल निकासी के लिए कम से कम 20 मिनट के साथ एक माउस इंजेक्षन.
- , 12 सप्ताह या isoflurane साँस लेना द्वारा बड़ी आयु के चूहों चतनाशून्य दर्द वापसी सजगता के अभाव की पुष्टि, और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से जानवरों euthanize.
- तेजी से पहले से स्थापित विशेषज्ञ प्रोटोकॉल का पालन दिल निकालें (जैसे, Kaestner एट अल. 26 और Louch एट अल. 27 देखें). अनावश्यक निचोड़ या खींचने से अटरिया के लिए किसी भी अनजाने नुकसान से बचें.
- ध्यान से सफल केन्युलेशन और दिल के छिड़काव के लिए महत्वपूर्ण है जो महाधमनी पोत दीवार, के माध्यम से एक सतत आड़ा काटने के किनारे स्थापित करने के लिए स्टंप संदंश और सीधे कैंची की एक जोड़ी का उपयोग समीपस्थ आरोही महाधमनी के ऊतकों की रक्षा.
- (समाधान 1 टेबल देखें) ठंडा में तुरंत नाममात्र सीए 2 + मुक्त छिड़काव बफर excised दिल स्थानांतरण. दिल पूरी तरह से जलमग्न होने तक अनजाने हवा का आवेश से बचने के लिए बफर में हवा के माध्यम से स्थानांतरण के दौरान clamped महान वाहिकाओं रखें. हृदय के संकुचन को बाधित करने के लिए बफर और बर्फ से ठंडा समाधान में BDM का प्रयोग करें.
- पर्याप्त 3D खेला आज के साथ एक दूरबीन ज़ूम माइक्रोस्कोप का उपयोगination.
- पूरी तरह से बफर के साथ भरा होना चाहिए, जो (सामान्य माउस दिल वजन के लिए बाहरी व्यास 0.81 मिमी) एक चिकनी, सतह के साथ दिल के मनोरम stereovision तहत महाधमनी cannulate 21 जी प्रवेशनी पॉलिश. तेजी से समाधान प्रवाह नियंत्रण के लिए अनुमति देता है एक 2 तरह Luer वाल्व के माध्यम से एक समीपस्थ समाधान जलाशय (जैसे, एक सिरिंज) को जोड़ने के द्वारा प्रवेशनी में कोई हवाई बुलबुले हैं कि सुनिश्चित करें.
- प्रवेशनी महाधमनी वाल्व और कोरोनरी धमनी की शाखाएं ऊपर लगभग 1 मिमी है जो महाधमनी, अंदर सही ढंग से तैनात है कि दूरबीन बढ़ाई तहत पुष्टि करें. बिल्कुल किसी भी माध्यम से पारित होने या प्रवेशनी साथ महाधमनी वाल्व के अनजाने वेध (यह स्थायी रूप से महाधमनी वाल्व बंद करने को बाधित और फलस्वरूप हृदय छिड़काव बाधित करेगा) से बचें.
- दो रेशम टांके का उपयोग प्रवेशनी के अंत के पास कस्टम बनाया, circumferentially उन्मुख विरोधी पर्ची खांचे को धीरे महाधमनी बाँधो. कोरोनरी arteri फ्लश नहीं हैकिसी भी बिंदु पर जबरदस्ती तों. (नीचे भी चर्चा खंड देखें या तो लगातार दबाव या निरंतर प्रवाह का उपयोग) समाधान भरा एक अनुकूलित और पूर्व calibrated छिड़काव प्रणाली के एक कसकर ढाले बहिर्वाह कनेक्टर को महाधमनी और दिल से जुड़ी प्रवेशनी, संशोधित Langendorff सेटअप उर्फ कनेक्ट करें.
- 37 डिग्री सेल्सियस (4 मिलीग्राम / मिनट लक्ष्य छिड़काव दर) में ऑक्सीजन छिड़काव बफर का उपयोग 4 मिनट के लिए जितनी जल्दी हो सके दिल छिड़कना. 37 डिग्री सेल्सियस पर 8-10 मिनट के लिए पाचन बफर (600 यू / एमएल collagenase प्रकार द्वितीय) युक्त collagenase के लिए छिड़काव स्विचन द्वारा पाचन शुरू करो. स्पष्ट दिल की सतह भर में बढ़ रही opaqueness, कोमलता, और ढीलापन सहित इसी तरह के ऊतक परिवर्तन की पुष्टि से ऊतक पाचन की प्रगति की निगरानी.
- आवश्यक निम्नलिखित पाचन के रूप में कार्डियक कक्षों काटना. एक दूरबीन खुर्दबीन के नीचे cannulated दिल प्लेस और पीछे दिल दीवार कल्पना. अवशिष्ट गैर कार्डियक ऊतक जैसे, फेफड़ों एक काटनाएन डी पोत भागों सूक्ष्म कैंची का उपयोग पाचन बफर में सेल संक्रमण से बचने के लिए (जैसे, 8 मिमी सीधे ब्लेड के साथ वसंत कैंची) चित्र 1 में दिखाया गया है.
- Collagenase पच दिल की विशेष कक्षों, क्षेत्रों, और / या कोशिकाओं काटा जाना चाहिए जो एक जांच सूची (चित्रा 1) का पालन करें: और / या सही आलिंद, मुक्त छोड़ दिया और / या सही निलय दीवार, और / या वेंट्रिकुलर पट छोड़ दिया.
- विशिष्ट हृदय के ऊतकों के विच्छेदन के लिए, सिलिकॉन प्लास्टिक elastomer के कई मिमी मोटी परत के साथ लेपित एक अपेक्षाकृत व्यापक और फ्लैट विच्छेदन स्नान का उपयोग करें. नीचे इलास्टोमेर परत के लिए एक ठीक कीट स्टील पिन के साथ दिल के शीर्ष को ठीक करें.
- सही आलिंद उपांग ध्यान हटाने की और सिर्फ atrioventricular वाल्व ऊपर सही आलिंद काटना. बाएं आलिंद के साथ विच्छेदन जारी रखें. काटना और रेशेदार वाल्व तंत्र त्यागें. अंत में, बाएँ और दाएँ मुक्त निलय दीवारों और पट और / या छोटे टुकड़ेऊतक भागों एर जरूरत के रूप में.
- प्रशिक्षुओं के लिए केवल नोट: गैर पचा माउस दिल के साथ शुरू, अभ्यास हासिल करने के लिए. संरचनात्मक अभिविन्यास की आसानी के लिए, collagenase पच माउस दिलों रूप के साथ जारी, चित्र 1 में दिखाया के रूप में दूरबीन दृष्टि के तहत. 3 डी शरीर रचना एक बार, मैनुअल हैंडलिंग दूरबीन दृष्टि के तहत सभी लगातार विच्छेदन कदम सहित ऊतक से निपटने का अभ्यास, और विच्छेदन कदम पर्याप्त familiarized कर रहे हैं ऊपर उल्लिखित.
- निलय myocyte (वीएम) सेल अलगाव के लिए: ताजा पाचन बफर के 2.5 मिलीलीटर में निलय ऊतक हस्तांतरण. कई अंग भागों, जैसे, अटरिया और निलय से एक साथ सेल isolations का प्रयास किया जाता है, तो एक दूसरा व्यक्ति, सेल हदबंदी की प्रक्रिया में से एक पैर पर लग सकता है दोनों को कम करने और कई हृदय के ऊतकों के समन्वित निपटने के माध्यम से चूहों के उपयोग का अनुकूलन. कदम उसके बाद 1.10 1.9.1-1.9.4, के साथ आगे बढ़ें.
- पूरे निलय ऊतक या तो काटनाया विशिष्ट भागों तत्संबंधी (जैसे, एल.वी., आर.वी., मुफ्त दीवारों, और / या पट) तेज कैंची का उपयोग 2.5 मिलीलीटर पाचन बफर में लगभग 1 मिमी 3 टुकड़ों में (उदाहरण के लिए, 8 मिमी सीधे ब्लेड के साथ वसंत कैंची) एक 60 मिमी पेट्री डिश में .
- धीरे एक हस्तांतरण विंदुक के साथ ऊतक टुकड़े की धीमी विचूर्णन द्वारा सेल निलंबन में वी एम एस अलग कर देना. सेल निलंबन में किसी भी हवा बुदबुदाती से बचें.
- वी एम सेल निलंबन को रोकने के बफर के 8 मिलीलीटर जोड़ें और एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में सेल निलंबन हस्तांतरण. शेष ऊतक टुकड़े लगभग 15 सेकंड के लिए तल पर व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें, लेकिन निलंबन में रहने के लिए अलग कक्षों के लिए काफी कम. इसके बाद, एक नया 15 मिलीलीटर ट्यूब सतह पर तैरनेवाला मात्रा के हस्तांतरण के माध्यम से वीएम निलंबन फसल. अत्यधिक ऊतक टुकड़े मौजूद हैं, तो वैकल्पिक रूप से सेल निलंबन से ऊतक टुकड़े अलग करने के लिए एक न्यूनतम 200 मीटर दूरी पर नायलॉन जाल का उपयोग करें.
- वी एम सेल निलंबन एक 15 मिलीलीटर सह के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करते हैं8 मिनट के लिए गंभीरता से nical ट्यूब.
- कदम धो: सतह पर तैरनेवाला निकालें और धीरे छिड़काव बफर के 10 एमएल में शेष वीएम गोली resuspend. दोहराएँ धोने कदम 1.9.5 (वैकल्पिक: धीरे धीरे जरूरत के रूप में सीए 2 + एकाग्रता बढ़ाने के लिए अतिरिक्त धोने कदम जोड़ें).
- 10 मिलीलीटर छिड़काव बफर में बसे वीएम गोली Resuspend और 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब (ट्यूब प्रति लगभग 50,000 वीएम कोशिकाओं) में शेष सेल निलंबन मात्रा वितरित.
- आलिंद myocyte (AM) सेल अलगाव के लिए: ताजा पाचन बफर के 1 मिलीलीटर में पच / विच्छेदित आलिंद ऊतक हस्तांतरण.
- एक छोटा सा पेट्री डिश (जैसे, 60 मिमी व्यास) में सूक्ष्म कैंची का उपयोग 1 मिलीलीटर पाचन बफर में लगभग 1 मिमी 3 टुकड़ों में आंशिक रूप से पचा आलिंद ऊतक में कटौती. धीरे हानिकारक तरल पदार्थ विमानों से बचने के लिए एक कट टिप के साथ एक 1 मिलीलीटर की प्लास्टिक पिपेट साथ विचूर्णन का उपयोग सेल निलंबन में पचा ऊतक टुकड़े से बाहर हूँ कोशिकाओं को अलग कर देना. के दौरानविचूर्णन सख्ती सेल निलंबन में किसी भी हवा बुदबुदाती से बचें. सेल निलंबन में किसी भी शेष collagenase गतिविधि गिरफ्तार करने के लिए, (10% BCS 50 माइक्रोन 2 CaCl) यांत्रिक आंदोलन के बाद, बंद करो बफर के 4 मिलीलीटर जोड़ें.
- एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में पूर्वाह्न सेल निलंबन स्थानांतरण. शेष ऊतक टुकड़े लगभग 15 सेकंड के लिए तल पर व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें, लेकिन निलंबन में रहने के लिए अलग कक्षों के लिए काफी कम. एक नया 15 मिलीलीटर ट्यूब का हल हस्तांतरण के माध्यम से स्वतंत्र हूँ कोशिकाओं से युक्त सतह पर तैरनेवाला मात्रा हार्वेस्ट.
- आरटी पर पूर्वाह्न सेल निलंबन, जैसे, 20 XG पर 2 मिनट अपकेंद्रित्र या - बेहतर झिल्ली अध्ययन के लिए - कोशिकाओं को एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 20 मिनट के लिए गंभीरता से धीरे धीरे बसने करते हैं.
- 5 मिलीलीटर छिड़काव बफर में पूर्वाह्न गोली resuspend धीरे सतह पर तैरनेवाला त्यागने और: चरण धो लें. 1.10.4 दोहराएँ.
- Resuspend पूर्वाह्न कोशिकाओं धीरे 5 मिलीलीटर छिड़काव बफर में. 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge टब में सेल निलंबन मात्रा में वितरित करेंतों (ट्यूब प्रति लगभग 1,000 AM कोशिकाओं).
- विश्लेषण और trypan नीले रंग धुंधला का उपयोग सेल उपज सहित हर दिल के लिए अलग सेल आबादी गुणवत्ता दस्तावेज़.
- इस के लिए, 1 के रूप में सेल निलंबन के 500 μl पतला: 1 मिलीलीटर कटौती पिपेट युक्तियों का उपयोग 1 / खंड खंड के साथ trypan नीले समाधान (अंतिम एकाग्रता 0.02%). बहुत / नीचे pipetting धीमा द्वारा धीरे कोशिकाओं और trypan नीले रंग मिलाएं. तुरंत कोशिकामापी सुधार एक NEUBAUER प्रकार सेल निलंबन युक्त trypan नीले लागू करते हैं और एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग बरकरार myocytes गिनती.
- स्पष्ट क्षति, झिल्ली blebs, intracellular trypan नीले (चित्रा 2) जमते बाधित स्त्रिअतिओन्स, contractures, और कोशिकाओं के साथ किसी भी कोशिकाओं को बाहर. इसके अलावा अनायास बाद कोशिका मृत्यु जल्दी हो जाता है जो कोशिकाओं, करार को बाहर निकालें. निलंबन में बरकरार कोशिकाओं की गणना का आकलन करने के लिए, पूरे नीले trypan बहिष्कृत जो नियमित स्त्रिअतिओन्स साथ ही हृदय myocytes उपयोगसेल मात्रा.
- प्रेषित प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा व्यक्तिगत आलिंद और निलय myocytes की अखंडता न्यायाधीश. प्रलेखन और आगे के विश्लेषण के लिए एक TIF फ़ाइल के रूप में उज्ज्वल क्षेत्र छवि सहेजें.
- हृदय सेल अखंडता के विश्लेषण के लिए निम्नलिखित मापदंड का उपयोग करें:
- दिखाई सेल मात्रा भर नियमित स्त्रिअतिओन्स की उपस्थिति की पुष्टि;
- दोनों सेल पक्षों पर पार्श्व सतह झिल्ली myofilaments के समानांतर की निरंतर अखंडता की पुष्टि;
- विशिष्ट सतह झिल्ली संरचनाओं की अखंडता को प्रतिबिंबित जो दोनों सेल पक्षों पर intercalated डिस्क पर तेज serrations कल्पना; और
- अगले अंतर्निहित सेल विशिष्ट उज्ज्वल क्षेत्र छवि आकृति विज्ञान (जैसे, ओवरले यौगिक imag के रूप में ImageJ साथ दोनों चित्र संयोजन स्थानीयकरण सहसंबंध के लिए धारा 3 में वर्णित के रूप में TATS झिल्ली की फ्लोरोसेंट संकेत (या immunolabeled caveolin-3 प्रोटीन या अन्य झिल्ली मार्कर) कल्पनाई).
- उज्ज्वल क्षेत्र छवियों से sarcomere लंबाई निर्धारित करते हैं. मतलब sarcomere लंबाई के लिए, क्रमिक रूप से गठबंधन sarcomere स्त्रिअतिओन्स की दूरी को मापने, और sarcomeres की संख्या से दूरी विभाजित करते हैं. सेल के अनुसार कम से कम दो स्थानों उपाय. ImageJ साथ वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर या ऑफलाइन के साथ विश्लेषण करते हैं.
नोट: uncoupling एजेंटों के साथ व्यवहार किया जाता है, माउस दिल से बरकरार आराम वी एम एस ~ 1.9 माइक्रोन 28 के एक मतलब sarcomere लंबाई दिखा.
- हृदय सेल अखंडता के विश्लेषण के लिए निम्नलिखित मापदंड का उपयोग करें:
- प्रेषित प्रकाश माइक्रोस्कोपी छवि से आकारिकी और व्यक्तिगत आलिंद और निलय myocytes के आयाम यों. AM और वीएम कोशिकाओं के आकार में काफी अलग है पर विचार करें. सेल की लंबाई, चौड़ाई, और क्षेत्र को मापने, और लंबाई की गणना: चौड़ाई का अनुपात.
- आदेशों बहुभुज चयन उपकरण का उपयोग कर ImageJ में प्रेषित प्रकाश छवि से 2 डी सेल आयामों का विश्लेषण और 3 चित्रा को, आरओआई प्रबंधक के अनुरूप जोड़ें. रूपात्मक सी हैंhanges विशिष्ट अध्ययन संदर्भों के भीतर की उम्मीद कर रहे हैं, सभी कोशिकाओं के लिए आगे दस्तावेज़ विशिष्ट माउस तनाव, आयु, लिंग, दिल के आकार, और बाद में डेटा वर्गीकरण के लिए किसी भी हस्तक्षेप.
लिविंग आलिंद और निलय myocytes में TATS झिल्ली के 2 धुंधला
- इमेजिंग चैम्बर लोड (जैसे, POC-R2) एक 42 मिमी कांच coverslip के साथ. Coverslip को स्थिर myocyte कुर्की के लिए, शारीरिक छिड़काव बफर (अंतिम एकाग्रता 0.2 मिलीग्राम / एमएल) में laminin स्टॉक के 1:10 कमजोर पड़ने से laminin समाधान के 20 μl तैयार करते हैं. कांच coverslip पर समान रूप से laminin समाधान के 20 μl बिखरा हुआ है.
- छिड़काव बफर में एक 50 माइक्रोन DI-8-ANEPPS समाधान के 800 μl तैयार करें. इसके लिए 780 μl शारीरिक बफर में 2 मिमी डि-8-ANEPPS शेयर समाधान के 20 μl पतला.
- वी एम एस दाग, कोशिकाओं को एक 1.5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में 8 मिनट के लिए गंभीरता से व्यवस्थित करते हैं. एम्स के दाग, या तो गुरुत्वाकर्षण अवसादन या सपा का उपयोग करने के लिए2 मिनट के लिए सेल निलंबन में (1.10.3 को देखें). सेल गोली की अनावश्यक आंदोलन से परहेज करते हुए एम्स और वी एम एस दोनों के लिए, ध्यान से सतह पर तैरनेवाला निकालें और धीरे से 800 μl समाधान (50 माइक्रोन) युक्त डि-8-ANEPPS में सेल गोली resuspend. तुरंत इमेजिंग कक्ष में laminin लेपित coverslip पर डि-8-ANEPPS / myocyte निलंबन हस्तांतरण.
- अंधेरे में आरटी पर 15 मिनट के लिए वीएम निलंबन दाग.
- धीरे धीरे एक पुस्तिका पिपेट साथ इमेजिंग कक्ष के पक्ष में ऊपर की ओर तरल पदार्थ meniscus के माध्यम से अतिरिक्त मात्रा को हटा दें. के बहुमत डि-8-ANEPPS दाग myocytes मजबूती laminin लेपित coverslip के साथ जुड़ा रहता है और हवा के संपर्क में हो जाना नहीं है की पुष्टि करें. अगला, धीरे धीरे गैर पक्षपाती कोशिकाओं सहित किसी भी अतिरिक्त तरल पदार्थ को हटाने के द्वारा पीछा किया छिड़काव बफर के 1 मिलीलीटर जोड़कर एक बार संलग्न myocyte निलंबन धो लो.
- ध्यान से धीरे धीरे टी की ओर से छिड़काव बफर के 1 मिलीलीटर के साथ दाग और सतह संलग्न myocytes उपरिशायीवह चैम्बर इमेजिंग. खुर्दबीन मंच पर इमेजिंग कक्ष रखें.
लिविंग आलिंद और निलय myocytes में TATS झिल्ली संरचनाओं के 3 इमेजिंग
- सामान्य तौर पर, ध्यान से TATS झिल्ली इमेजिंग के लिए उपलब्ध सर्वोत्तम संभव फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप विकल्प (ओं) का चयन करें. Confocal इमेजिंग के लिए, हाल पीढ़ी, अनुकूलित पीएमटी सरणी डिटेक्टरों और फ्लोरोसेंट संकेत तीव्रता अधिकतम कि फोटोन रीसाइक्लिंग रास्ते के साथ आधुनिक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पर विचार करें. TATS के छोटे विवरण के confocal इमेजिंग के लिए झिल्ली संरचनाओं एक 63X 1.4 एनए तेल उद्देश्य या उपयोग - उपलब्धता पर निर्भर करता है -. उच्च के सामान्य सिद्धांतों के लिए कोल एट अल 34 से myocyte विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए समीक्षा के रूप में सबसे छोटी TATS जानकारी के लिए एक STED superresolution माइक्रोस्कोप का उपयोग संकल्प प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, चर्चा खंड देखें.
- , आदर्श सभी डि-8-ANEPPS दाग intracellular मेम सबसे पता लगाने के लिए इमेजिंग मापदंडों सेटएक दिया myocyte इमेजिंग विमान के अंदर branes. अधिक से अधिक लेजर शक्ति के 3% से कम, उत्तेजना 458 एनएम जैसे;: लेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग के लिए प्रारंभिक बिंदु के रूप में निम्नलिखित मानकों का प्रयोग करें 550 एनएम और 740 एनएम के बीच उत्सर्जित संकेत का पता लगाने; डिटेक्टर लाभ (जैसे, मास्टर आदेश 800); और 900 एनएम का एक ऑप्टिकल टुकड़ा मोटाई के लिए पिनहोल 1 ए.यू.. संकेत करने वाली शोर अनुकूलन करने के लिए इन मापदंडों को समायोजित करें.
- उपयुक्त (आंकड़े -4 ए और 4 बी) के रूप में एक अक्षुण्ण AM या वी एम सेल का चयन करने के उज्ज्वल क्षेत्र मोड का प्रयोग करें. सेल चौड़ा नियमित स्त्रिअतिओन्स और बराबर sarcomere रिक्ति, तेज सतह किनारों और serrations सभी चार सेल पक्षों पर, पार्श्व सतह झिल्ली की निरंतर अखंडता, और का अभाव: संक्षेप के रूप में कक्षों का चयन करने के लिए सेल अखंडता न्याय करने के लिए कैसे प्रासंगिक मापदंड के लिए 1.12 का हवाला किसी भी झिल्ली blebs.
- एक केंद्रीय intracellular myocyte अनुभाग का एक नमूना छवि ले लो. आरओआई "फसल" समारोह → उपयोग को समायोजित करने के लिए; अंतिम पिक्सेल आकार 100 एनएम x 100 एनएम उपाय → फसल खिड़की समायोजित. Myocyte के प्रमुख (अक्षीय / अनुदैर्ध्य) अक्ष के साथ पत्र व्यवहार करने के लिए फसल खिड़की की एक्स अक्ष समायोजित करें.
- अंतिम इमेजिंग विमान का चयन करें. मैन्युअल Z-दिशा में उचित इमेजिंग विमान का चयन करने के लिए एक छवि फ्रेम का उपयोग करें. टी छोटी नली और एक छोटी नली घटकों सहित TATS झिल्ली, फोकल हवाई जहाज़ में नेत्रहीन स्पष्ट कर रहे हैं कि पुष्टि करें. एक ठेठ intracellular इमेजिंग विमान intracellular संदर्भ बिंदु के रूप में एक नाभिक शामिल हो सकते हैं कि ध्यान दें. आंकड़े -4 ए और 4 बी में उदाहरण को देखें.
नोट: सामान्य में, जितना संभव हो कम लेजर प्रकाश को सेल जोखिम रखना. यदि संभव हो तो, हृदय myocytes में इष्टतम फोकल विमान निर्धारित करने के लिए एक छवि फ्रेम का उपयोग करें. - लगभग 0.5 μsec करने पिक्सेल ध्यान केन्द्रित करना समय समायोजित करें. 16x औसतन चुने और स्नैपशॉट के रूप में छवि रिकॉर्ड. उपयुक्त इमेजिंग विमान एक स्थापित करने के लिए छवि स्नैपशॉट चरण को दोहराएँजरूरत के रूप में 3.5 में TATS झिल्ली संरचनाओं के लिए रेखांकित किया है.
- अंतिम छवि को बचाने और फाइल अपने लक्ष्य फ़ोल्डर में सहेजा गया है कि इस बात की पुष्टि. सामान्य में, विश्लेषण सॉफ्टवेयर की वर्दी आवेदन के लिए एक ही प्रारूप (उदाहरण के लिए, एल एस एम) के सभी छवि फ़ाइलों को बचाने के लिए. पहले किसी भी छवि विश्लेषण करने के लिए, एक बार फिर से (कदम 1.12.1 तहत सूचीबद्ध मापदंड पर विचार) बंद लाइन पर्याप्त सेल अखंडता की पुष्टि और विश्लेषण से किसी भी क्षतिग्रस्त कोशिकाओं को बाहर. आंकड़े 4C और 4D में उदाहरणों को देखें.
TATS झिल्ली नेटवर्क और उसके घटकों के 4 विश्लेषण
TATS झिल्ली घटकों के प्रत्यक्ष विश्लेषण के लिए निम्नलिखित छवि प्रसंस्करण कदम आंकड़े 5A और 5B में ऊपर से नीचे कार्यप्रवाह चित्र के रूप में संक्षेप हैं.
- फिजी (http://fiji.sc/) में एक डि-8-ANEPPS दाग myocyte की छवि फ़ाइल खोलें, ImageJ की एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध संस्करण के लिए आवश्यक विश्लेषण प्लगइन्स जिसमेंछवि प्रसंस्करण. अधिक जानकारी के लिए Schindelin एट अल 29 देखें.
- इस रूप में सहेजें → Tif → छवि → फ़ाइल सहेजें.
- TATS झिल्ली घटकों का विश्लेषण करने के लिए, के रूप में दिखाया तो आरओआई सीमा बाहरी सतह झिल्ली (sarcolemma) को छोड़कर और TATS झिल्ली के intracellular भागों सहित चित्रित करने के लिए "बहुभुज चयन" उपकरण का उपयोग, बाहरी सतह झिल्ली संकेत छोड़कर उचित लागत पर लाभ का चयन चित्रा 5A (आरओआई). → उपकरण → आरओआई प्रबंधक विश्लेषण लागू करने के द्वारा "आरओआई प्रबंधक" के लिए चयनित आरओआई जोड़ें.
- , TATS घटकों के उन्मुखीकरण के विश्लेषण के लिए एक विशिष्ट आरओआई का चयन मुख्य अनुदैर्ध्य सेल अक्ष और समानांतर में छवि एक्स अक्ष संरेखित करने के लिए. सेल थोड़ा घुमावदार है, तो कई ROIs चयन और व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक रॉय संरेखित. विश्लेषण से किसी भी नाभिक बाहर निकालें. विश्लेषण से किसी भी जरूरत से ज्यादा घुमावदार कोशिकाओं को बाहर क्योंकि आर के सटीक संरेखणOIS तेजी से मुश्किल हो और विश्लेषण के दौरान अभिविन्यास त्रुटियों में वृद्धि होगी.
- बाहरी सतह झिल्ली से किसी भी अवांछित संकेत जानकारी हटाएँ: संपादित → साफ बाहर "चयनित आरओआई" (चित्रा 5A) उत्पन्न करने के लिए. चयनित आरओआई केवल TATS नेटवर्क के साथ अनुरूप जो intracellular झिल्ली अंश, जिसमें यह सुनिश्चित करें.
- चित्रा 5A में दस्तावेज के रूप में बाद में मात्रात्मक विश्लेषण करने से पहले छवि प्रसंस्करण कदम (कमांड) के निम्नलिखित श्रृंखला को पूरा करें.
- घटाएँ पृष्ठभूमि → → प्रक्रिया पर क्लिक करें. 5 पिक्सल के लिए रोलिंग गेंद त्रिज्या निर्धारित करें.
नोट: छवि विश्लेषण किया 100 एनएम x 100 एनएम के एक पिक्सेल आकार की है किया जाना है अगर 5 पिक्सल के लिए रोलिंग गेंद त्रिज्या निर्धारित करें. अन्य पिक्सेल आकार के लिए लगभग 500 एनएम के एक भौतिक त्रिज्या के अनुरूप जो बॉलीवुड की संख्या को रोलिंग गेंद त्रिज्या निर्धारित किया है. - स्थानीय विपरीत बढ़ाने → → प्रक्रिया पर क्लिक करें (CLAHई). , 256, 49 के लिए 3 के लिए अधिकतम ढलान, और "कोई नहीं" का मुखौटा हिस्टोग्राम डिब्बे ब्लॉक आकार निर्धारित करें.
- चिकना → → प्रक्रिया पर क्लिक करें.
- → प्लगइन्स → विभाजन → सांख्यिकीय क्षेत्र विलय पर क्लिक करें. दिखाएँ मूविंग पर क्लिक करें → Q100 के लिए मानकों सेट.
- सांख्यिकीय क्षेत्र की पूरी प्रक्रिया की पुष्टि एक नई छवि फ्रेम का स्वत प्रस्तुति ने संकेत दिया और लेबल "एस आर एम क्यू = 100" प्रतीत होता है कि इस बात की पुष्टि विलय. इस छवि फ़ाइल के साथ निम्नलिखित कदम आगे बढ़ें. → छवि → प्रकार → 8 बिट पर क्लिक करें.
- → दहलीज समायोजित → छवि → पर क्लिक करें. एक कम संकेत तीव्रता के साथ TATS घटकों के विशेष बचने के बहिष्कार में सबसे पता लगाने के लिए पर्याप्त रूप से कम सीमा, आदर्श सभी TATS संरचनाओं, चुनें (प्रारंभिक बिंदु के रूप में 40 की एक सीमा का उपयोग करें). चित्रा 6 में "प्रतिनिधि परिणाम" अनुभाग विस्तृत डेटा उत्पादन के लिए और उदाहरणों से परामर्श(255 की ऊपरी सीमा). सीमा मापदंडों का अंतिम चयन दस्तावेज़. सीमा का सही विकल्प की वजह से पृष्ठभूमि शोर को झूठी सकारात्मक संकेतों केवल विशिष्ट TATS झिल्ली संरचनाओं का उत्पादन लेकिन नहीं होना चाहिए ध्यान दें.
- कंकाल संरचना के (जिले) निरंतरता मैच चाहिए जो मध्यवर्ती और उच्च प्रतिदीप्ति संकेत स्तर के लिए विशेष रूप से निकाला कंकाल डेटा, बनाम TATS छवि विवरण का सही superimposition की पुष्टि करें. एक उचित सीमा की पहचान हो जाने के बाद, विश्लेषण के दौरान सभी छवियों को इसी सीमा लागू करते हैं और कंकाल डेटा लगातार पूर्वाग्रह के इस संभावित स्रोत को कम करने के लिए की तुलना में मूल संकेत के ओवरले तुलना दोहराएँ.
- लागू करें पर → क्लिक करें: "सीमा" के तहत चित्रा 5 में दिखाया गया के रूप में छवि डेटा द्विआधारी हो जाता है.
- → पर क्लिक प्लगइन्स → कंकाल → पांडुलेख (2 डी / 3 डी). द्वारा TIF फ़ाइल के रूप में (चित्रा 5 में दिखाया गया है) skeletonized 2 डी छवि सहेजें→ Tif के रूप में सहेजें → फ़ाइल → पर क्लिक करें. प्लगइन्स → पर क्लिक करके मात्रात्मक डेटा उत्पादन के लिए skeletonized छवि फ़ाइल का विश्लेषण → कंकाल (2 डी / 3 डी) का विश्लेषण. कोई नहीं: छँटाई चक्र विधि चुनें. परिणामी डेटा तालिका के स्वत: पीढ़ी की पुष्टि करें.
- Txt फ़ाइल के रूप में स्वतः उत्पन्न डेटा तालिका सहेजें. प्रासंगिक मात्रात्मक मापदंडों जैसे चुनें, शाखा अंक की कुल संख्या या चित्रा 7 में अनुकरणीय डेटा द्वारा दिखाया के रूप में औसत शाखा लंबाई. पूरक / समर्थन सॉफ्टवेयर उपकरण एक्सेल की तरह और के रूप में उपयुक्त के साथ आगे डेटा विश्लेषण करने पर विचार करें.
- घटाएँ पृष्ठभूमि → → प्रक्रिया पर क्लिक करें. 5 पिक्सल के लिए रोलिंग गेंद त्रिज्या निर्धारित करें.
- व्यक्तिगत छवियों और / या छवि बैचों के बीच विश्लेषण मिलाना 4.5 के तहत वर्णित सभी आवश्यक कदम सहित जब भी संभव स्वचालित छवि प्रसंस्करण दिनचर्या का उपयोग करने पर विचार करें. फिजी के लिए प्रोग्राम एक छवि प्रसंस्करण मैक्रो (जरूरत के रूप में प्रोग्रामिंग समायोजित) युक्त उदाहरण पूरक कोड फ़ाइल का प्रयोग करें.
- में विश्लेषण"दिशात्मकता" प्लगइन फिजी से skeletonized छवि डेटा से सभी या चुनिंदा TATS नेटवर्क घटकों के जुदा झुकाव. संबंधित अक्षीय रूप से उन्मुख एक छोटी नली या transversally उन्मुख टी छोटी नली घटकों 0 डिग्री या 90 डिग्री डिब्बे से प्रतिनिधित्व कर रहे हैं, जहां एक दिशात्मकता हिस्टोग्राम उत्पन्न करता है. छवि उन्मुखीकरण के सही संदर्भ नोट और यह संख्या 8 और प्रतिनिधि परिणाम के रूप में दिखाया वीएम सेल का मुख्य (अनुदैर्ध्य) 0 ° अक्ष के साथ मिलकर अनुरूप करने के लिए छवि के एक्स अक्ष के लिए महत्वपूर्ण है कि.
- पर → → दिशात्मकता → विधि बताने का विश्लेषण करें क्लिक करें: फूरियर घटकों, Nbins 180, हिस्टोग्राम -45 → शुरू प्रदर्शन तालिका पर क्लिक करें.
- Txt फ़ाइल के रूप में जुड़े हिस्टोग्राम डेटा सहित नव सृजित और प्रदर्शित परिणाम तालिका सहेजें. एक्सेल की तरह है और जरूरत के रूप में मानार्थ सॉफ्टवेयर उपकरण द्वारा TXT फ़ाइल डेटा के आगे के विश्लेषण पर विचार करें.
- के उपवर्गों उत्पन्न करने के लिएएक ही हालत (और संभवतः अन्य शर्तों) के तहत इलाज सभी कोशिकाओं के लिए समूहबद्ध डेटासेट जैसे, के रूप में डेटा, विश्लेषण उचित रूप में सभी प्रासंगिक छवियों के लिए 4.1-4.7 चरणों को दोहराएँ. औसत मूल्यों प्राप्त करने के क्रम में एक संयुक्त एक्सेल फाइल में सभी छवियों से skeletonized डेटा मापदंडों आयात करें. इसके अलावा, गणना और औसत दिशात्मकता हिस्टोग्राम उत्पन्न करने के लिए एक संयुक्त एक्सेल फाइल में एक ही समूहबद्ध डाटासेट से सभी दिशात्मकता हिस्टोग्राम डेटा आयात करते हैं. जरूरत के रूप में व्यक्तिगत या बीच में विभिन्न उपचार समूहों के लिए ब्याज की अतिरिक्त TATS नेटवर्क मापदंडों का विश्लेषण करने के लिए समूहबद्ध डेटासेट की आगे की प्रक्रिया पर विचार करें.
Representative Results
इसके अलावा, TATS झिल्ली नेटवर्क विश्लेषण करने के लिए intracellular सीए 2 + इमेजिंग, पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, या औषधीय खुराक प्रतिक्रिया पढ़ाई की तरह अधिक इस्तेमाल कोशिका जीव विज्ञान तकनीक की एक संख्या अटरिया या निलय से उच्च गुणवत्ता प्राथमिक सेल अलगाव पर निर्भर या चयन हृदय के ऊतकों के कुछ हिस्सों परिपक्व संरचनात्मक, विभेदित और शारीरिक बरकरार हृदय myocytes के लक्षण वर्णन सक्षम करने के लिए. इसलिए, धारा 1 में वर्णित AM और वीएम कोशिकाओं के लिए अलगाव और गुणवत्ता मूल्यांकन बरकरार झिल्ली और सेल अखंडता पर गंभीर रूप से निर्भर करता है जो यहाँ वर्णित TATS नेटवर्क विश्लेषण, सहित कई विभिन्न प्रश्नों के लिए अंत में उपयोगी होते हैं.
चित्रा 1 कार्डियक ऊतक विच्छेदन माउस दिल में आलिंद कक्षों के साथ शुरू करने के साथ आगे बढ़ने के लिए कैसे छवियों के एक कदम के लिहाज से मार्गदर्शन प्रदान करता है. इसके बाद, निलय कक्षों और पट तैयार कर रहे हैं एकजरूरत के रूप में विच्छेदित होगी. सटीक चयन और सही ऊतक भागों की तैयारी मज़बूती से पर्याप्त सेल शुद्धता के साथ हूँ और वीएम isolations स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है. Collagenase पाचन के बाद यह आलिंद और निलय ऊतक के बीच विच्छेदन की सही लाइन की पहचान करने के लिए अपेक्षाकृत मुश्किल हो सकता है, अभी तक हूँ और वीएम कोशिकाओं सेल निलंबन में अनियंत्रित मिश्रित कर रहे हैं एक बार, यह मिश्रित सेल आबादी को उल्टा करने के लिए असंभव है. इसलिए, संरचनात्मक अभिविन्यास, 3 डी ऊतक दृश्य पचा ऊतक से निपटने के साथ पर्याप्त अनुभव, विशिष्ट ऊतक भागों और उनके विच्छेदन लाइनों की सही पहचान के सभी सेल अलगाव की सफलता के लिए योगदान देगा.
अलिंद ऊतक चित्रा 1.Dissection. (ए) दिल का अग्र भाग सामना, दो शल्य चिकित्सा हैutures एक 21 जी स्टील प्रवेशनी के स्टंप अंत करने के लिए समीपस्थ महाधमनी तय. विच्छेदन के दौरान आलिंद चैम्बर देखने में बाधा डालने फेफड़े के ऊतकों शेष हृदय आधार शो की ओर (बी) देखें. ला, आलिंद छोड़ दिया; आरए, सही आलिंद. (सी) शेष lungtissue और महान वाहिकाओं आलिंद कक्षों का उपयोग करने के लिए हटा दिया गया. काला त्रिकोण, फेफड़े के धमनी भरा; धारीदार त्रिकोण, फेफड़े के नसों; सफेद त्रिकोण, ऊपरी रग कावा भरा; बॉक्सिंग त्रिकोण, कम रग कावा. (डी) संदंश आलिंद उपांग पकड़ जबकि पहले, सही आलिंद दीवार विच्छेदित है. (ई) सही आलिंद कक्ष गुहा में देखें. काला त्रिकोण बरकरार अलिंदीय पट निशान. (एफ) विच्छेदन बाएं आलिंद कक्ष गुहा में प्रवेश करने के लिए जारी रखा है. (जी) को छोड़ दिया और सही आलिंद का पूरा विच्छेदन के बाद, atrioventricular वाल्व दिखाई देने लगते हैं. रेशेदार वाल्व तंत्र विच्छेदित और subseq को खारिज कर दिया हैuently केवल निलय मांसपेशियों के ऊतकों फसल. पृथक बाएँ और दाएँ अटरिया की (एच) पोस्टीरियर देखें. ला, आलिंद छोड़ दिया; आरए, सही atrium.Scale सलाखों: 700 माइक्रोन.
सेल isolations की गुणवत्ता निर्धारित करने के लिए, चित्रा 2 एम्स और वीएमएस के लिए दोनों, उपज और ठेठ रॉड या धारीदार बरकरार myocytes आकार ईंट की व्यवहार्यता का आकलन दौरान ठेठ सेल उदाहरण प्रदान करता है. लिटिल आसानी खंड 1.11 में वर्णित के रूप में trypan नीले बहिष्कार सहित पहचाना जा सकता है, असामान्य जरूरत से ज्यादा घुमावदार morphologies, या असामान्य गोलाकार आकार कोशिकाओं के साथ नेत्रहीन अगोचर के रूप में भी बुरी तरह से क्षतिग्रस्त कोशिकाओं को क्षतिग्रस्त. नीले कोशिकी trypan के संपर्क में जब बरकरार myocytes उज्ज्वल और homogenously धारीदार रहते हैं, क्षतिग्रस्त कोशिकाओं को आम तौर पर कई झिल्ली blebs दिखाने के लिए और / या जल्दी trypan नीले intracellularly का संकेत झिल्ली क्षति जमा. हालांकि, अपने आप में trypan नीले unnecessari के माध्यम से कोशिकाओं को नुकसान पहुँचा सकते हैंly लंबी ऊष्मायन और तत्काल सेल गुणवत्ता मूल्यांकन इसलिए अनिवार्य है. Myofilament contracture या सकल सतह क्षति समझौता सेल अखंडता की तरह कोशिका क्षति की अधिक स्पष्ट रूपों के उदाहरण आंकड़े 4C और 4D में दिखाए जाते हैं. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2 Trypan नीले अपवर्जन सेल धुंधला हो जाना. पृथक (ए) कर रहा हूँ और (बी) वीएम कोशिकाओं trypan नीले रंग के साथ निलंबन में मिलाया और 40Xmagnification पर दिखाया एक औंधा प्रकाश माइक्रोस्कोप से कल्पना कर रहे हैं. Leaka indicatesmembrane जो trypan नीले अप लेने thatabnormal गोलाकार (ए) में कोशिकाओं और (बी), नोटजीई और संरचनात्मक क्षति. के रूप में दिखाया विपरीत, अक्षत झिल्लियों के साथ centralAM और वीएम कोशिकाओं trypan नीले बाहर. इसके अलावा, उस बरकरार पूर्वाह्न ध्यान दें और वीएम कोशिकाओं उनके सेल मात्रा भर sarcomere स्त्रिअतिओन्स, nomembrane blebs, और दोनों पार्श्व पक्षों पर तेज किनारों और दोनों intercalated डिस्क दिखा. स्केल सलाखों: 20 माइक्रोन.
10 6 5 x 10 5 से वी एम एस के सफल अलगाव, सेल पैदावार के बाद एक माउस दिल पाचन से उम्मीद की जा सकती. एम्स की उपज 3 एक्स 10 3 4 10 एक्स 3 के लिए छड़ के आकार, trypan नीले छोड़कर कोशिकाओं के क्रम में काफी कम है. वी एम के विपरीत, isolations कभी कभी भी अनुभवी हाथों में असफल हूँ. चरण 1.11 कैसे निलंबन में पृथक स्वस्थ कोशिकाओं की उपज का अनुमान लगाने के प्रक्रियाओं का सार. व्यक्ति हूं या वी एम सेल वियोजन के लिए 3 चित्र में दिखाया गया के रूप में इसके अलावा, कदम 1.13 के माध्यम से औसत सेल आयाम तय या वी एम सेल आबादी बनाम पक्ष द्वारा साइड (आवश्यकतानुसार) से तुलना करने के लिए. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
हृदय myocytes की 3.Bright क्षेत्र morphometric विश्लेषण चित्रा. वीएम समोच्च कदम 1.13 के तहत वर्णित छवि विश्लेषण उपकरणों द्वारा पता लगाया गया था. मार्क नेत्रहीन और विश्लेषण के लिए बाहरी सतह झिल्ली से परिभाषित सेल बाह्य सीमा को परिभाषित करने के लिए बहुभुज चयन उपकरण का प्रयोग करें. विज्ञापन आरओआई प्रबंधक को ब्याज (आरओआई) की चयनित क्षेत्र -1 डी दूरी माप द्वारा पीछा किया. चौड़ाई अनुपात: वीएम आयाम बनाम बजे के तुलनात्मक अध्ययन के लिए, यह सेल की लंबाई, चौड़ाई, और क्षेत्र दस्तावेज़ करने के लिए, और लंबाई की गणना करने के लिए उपयोगी है.
बरकरार आलिंद और निलय myo की चित्रा 4.Live झिल्ली धुंधलाcytes. प्रकाश और जीने का confocal छवियों प्रेषित इसी डि-8-ANEPPS बरकरार (ए) दाग हूँ और (बी) वीएम कोशिकाओं. इसके विपरीत, 1.2 माइक्रोन का एक sarcomere लंबाई के साथ एक आंशिक रूप से अनुबंधित है और संभावित क्षतिग्रस्त AM (सी) में दिखाया गया है. अनुबंधित myocytes आम तौर पर असामान्य रूप से छोटा दिखाने के लिए और विकृत TATS संरचनाओं, इसलिए आगे के विश्लेषण से बाहर रखा गया है. कोशिका झिल्ली दोष के लिए एक अन्य महत्वपूर्ण सूचक में एक वी एम (डी) के रूप में दिखाया झिल्ली blebs (लाल त्रिकोण) कर रहे हैं. झिल्ली blebs blebs साथ क्षतिग्रस्त सतह झिल्ली संरचनाओं और कोशिकाओं आगे TATS विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए प्रतिनिधित्व करते हैं. इसके अलावा, वीएम जाहिरा तौर पर (तारांकन द्वारा चिह्नित) इसके निचले बाएं हिस्से की एक पूरी हिस्सा गायब सकल नुकसान से पता चलता है. संक्षेप में, प्रेषित प्रकाश और confocal छवियों की तुलना द्वारा, कोशिकाओं आकारिकी और सतह intactness दस्तावेज और फ्लोरोसेंट संकेत जानकारी के साथ संयुक्त है. 'एन' के निशान परमाणुCLEI TATS झिल्ली दाग के विश्लेषण से छोड़े गए. पीला सलाखों के ऊपर प्रस्तुत वही confocal छवि से ROIs बढ़ाया संकेत मिलता है. स्केल सलाखों:. 10 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
आंकड़े -4 ए और 4 बी में दिखाया गया है एक पर्याप्त संकेत करने वाली शोर अनुपात के साथ TATS झिल्ली के confocal छवियों आगे मात्रात्मक विश्लेषण के लिए स्वीकार कर रहे हैं. TATS झिल्ली विश्लेषण फ्लोरोसेंट सीधा संकेत घटकों से व्युत्पन्न skeletonized डेटा पर आधारित है. 5 4.3-4.5 कदम से विस्तार से वर्णन किया गया हैं जो व्यक्तिगत छवि प्रसंस्करण कदम के कार्यप्रवाह चित्र से पता चलता है. ये कदम प्रत्येक अलग वी एम (चित्रा 5A) के लिए के रूप में दिखाया सीधा TATS झिल्ली नेटवर्क का प्रतिनिधित्व skeletonized छवियों का उत्पादन और फाई (कोशिकाओं हूँgure 5 ब).
TATS नेटवर्क का एक skeletonized छवि के लिए नेतृत्व जो चित्रा 5.Workflow फ्लोरोसेंट TATS छवियों की skeletonization के लिए. छवि प्रसंस्करण कदम व्यक्तिगत कदम दर कदम छवि उदाहरणों से दोनों एक डि-8-ANEPPS के लिए प्रतिनिधित्व कर रहे वीएम (ए) और AM दाग (बी). व्यक्तिगत छवि प्रसंस्करण कदम के लिए, धारा 4 देखें. स्केल सलाखों में मतभेद नोट:. 20μm (ए) और 10μm (बी) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
खंड 4.5 में वर्णित के रूप में छवि प्रसंस्करण के दौरान एक महत्वपूर्ण कदम है, डेटा binarization के लिए उचित सीमा निर्धारित करते हैं.6. परिणामस्वरूप द्विआधारी छवि केवल TATS नेटवर्क से सच झिल्ली संकेतों नहीं बल्कि पृष्ठभूमि संकेत शोर से गलत thresholding द्वारा निकाली गई झूठी संरचनाओं को शामिल करना चाहिए. फिर भी, यह सीमा सच TATS घटकों ग़लती छवि विश्लेषण के दौरान खो नहीं कर रहे हैं कि इस तरह के सभी सच्चे TATS संरचनाओं का पता लगाने के लिए काफी कम है कि महत्वपूर्ण है. 6 कैसे डेटा binarization दौरान सीमा का चयन करने की प्रक्रिया को दिखाता है चित्रा. 40 की एक सीमा आंकड़े 6B में दिखाया गया है और 6C पीला त्रिकोण द्वारा संकेत के रूप में हल्के अक्षीय झिल्ली संरचनाओं (एटीएस) का पता नहीं लगा चित्रा 6A के रूप में दिखाया 60 का, एक उच्च सीमा जैसे चुनने, व्यक्तिगत रूप से सब सच TATS संरचनाओं का पता लगाने के लिए उपयुक्त लगता है के रूप में जबकि . द्वारा संकेत के रूप में चित्रा 6D में दिखाया गया है इसके विपरीत, 20 के एक कम सीमा जैसे चुनने पृष्ठभूमि शोर के रूप में झूठी सकारात्मक TATS संरचनाओं का गलत पता लगाने के लिए जाता हैपीला त्रिकोण.
चित्रा 6.How TATS छवि डेटा की skeletonizing दौरान संकेत सीमा निर्धारित करने के लिए. उदाहरण प्रत्येक (4.5 कदम में वर्णित) डेटा binarization दौरान विभिन्न थ्रेसहोल्ड के लिए उत्पन्न TATS कंकाल दिखा. अपर छवियों: फिजी का उपयोग कर सीमा समायोजन दिखा. लोअर छवियों: इसी इनपुट प्रतिदीप्ति छवि के साथ skeletonized छवियों और बढ़ाया क्षेत्रों के ओवरले संकेत के रूप में. एक उच्च सीमा जैसे, में लागू 60 (ए) बढ़ाया खंड में पीला त्रिकोण द्वारा संकेत के रूप में सब सच TATS संरचनाओं का पता लगाने के लिए जाहिरा तौर पर उचित नहीं है. (बी) और (सी) में लागू 40 की एक सीमा एक सीमा से कम उदाहरण है, जबकि पृष्ठभूमि शोर का पता नहीं लगा सही ढंग से सभी TATS संरचनाओं का पता लगाता है और., 20 (घ) ग़लती से गैर मौजूदा झिल्ली संरचनाओं की झूठी सकारात्मक संकेतों का उत्पादन जिससे TATS संरचनाओं के रूप में पृष्ठभूमि शोर को दिखाता है और. झूठी सकारात्मक संकेतों बढ़ाया इनसेट में पीला त्रिकोण के संकेत हैं. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
"कंकाल (2 डी / 3 डी) का विश्लेषण" प्लगइन skeletonized TATS संरचनाओं का विस्तृत विश्लेषण का समर्थन करता है. #branches, #junctions, # अंत बिंदु voxels, औसत शाखा लंबाई, #triple अंक, #quadruple अंक, और अधिकतम शाखा लंबाई: एक बार प्लगइन निम्नलिखित कंकाल मानकों के साथ एक डेटा तालिका का उत्पादन, मार डाला. सभी संभव उत्पादन मानकों के विस्तृत विवरण के लिए tohttp कृपया देखें: //fiji.sc/wiki/index.php/AnalyzeSkeleton और संबंधित लेख 29-31. एक ठेठ डेटा तालिका उत्पादन चित्रा 7A में दिखाया गया है.
आरओआई प्रति कुल कंकाल की लंबाई:
Σ (#branches एक्स औसत शाखा लंबाई) = 5155 पिक्सल = 515.5 माइक्रोन
कंकाल की कुल लंबाई छवि क्षेत्र के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है. नीचे के रूप में दिखाया चित्रा 7 0.64μm की सामान्यीकृत कंकाल लंबाई में दिखाया गया है उदाहरण के लिए / माइक्रोन 2 और सभी जंक्शनों की राशि की गणना कर रहे हैं:
सामान्यीकृत कंकाल की लंबाई:
515.5 मीटर / 803.6 माइक्रोन 2 = 0.64 माइक्रोन / माइक्रोन 2
जंक्शनों की सामान्यीकृत संख्या:
155 जंक्शनों / 803.6 माइक्रोन 2 2
Skeletonized छवियों से 7.Automated डेटा उत्पादन चित्रा. (ए) (बी) में दिखाया गया skeletonized छवि से 'कंकाल विश्लेषण (2 डी / 3 डी)' प्लगइन द्वारा उत्पन्न एक ठेठ डेटा स्प्रेडशीट. संभव उत्पादन मानकों का विस्तृत विवरण का उल्लेख करने के लिए कृपया http://fiji.sc/wiki/index.php/AnalyzeSkeleton . इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 5 में 4.5 के तहत वर्णित और सचित्र छवि प्रसंस्करण कदम पूरक कोड फ़ाइल के रूप में प्रदान की एक फिजी मैक्रो का उपयोग कर स्वचालित किया जा सकता है 4.3 और 4.4 के माध्यम से उत्पादन इनपुट छवियों के ढेर को पूरा करने के लिए लागू किया जा सकता है. मैक्रो मैक्रो आदेशों का उपयोग स्वचालित विश्लेषण के लिए प्रत्येक स्वतंत्र उपचार समूह के लिए व्यक्तिगत इनपुट छवि के ढेर तैयार करके उदाहरण के लिए, पूर्ण डाटासेट समूहों के विश्लेषण के लिए फायदेमंद हो सकता है.
उल्लिखित सॉफ्टवेयर रणनीति आगे सभी घटकों के लिए TATS नेटवर्क अभिविन्यास विश्लेषण में सक्षम बनाता है. इस के लिए, हिस्टोग्राम डेटा सभी TATS घटक झुकाव के उन्मुखीकरण वितरण दिखा पैदा करता है जो "दिशात्मकता" प्लगइन (http://fiji.sc/Directionality) 29,31 का उपयोग करें. इनपुट छवि के एक्स अक्ष एक दिया हूँ या वी एम सेल की मुख्य धुरी से मेल खाती है, तो आड़ा घटकों 90 और द्वारा प्रतिनिधित्व किया जाएगा, जबकि अक्षीय (अनुदैर्ध्य) TATS घटकों, 0 ° बिन द्वारा प्रतिनिधित्व किया जाएगा# 176; बिन. 8 अनुकरणीय दिशात्मकता एक बजे (8B) सेल बनाम एक वी एम (8A) के लिए skeletonized TATS छवियों से histograms पता चलता है. एक ठेठ वी एम की दिशात्मकता हिस्टोग्राम 0 डिग्री और 90 डिग्री पर एक डबल चोटी वितरण से पता चलता है, वहीं पूर्वाह्न हिस्टोग्राम 0 डिग्री पर एक भी प्रमुख शिखर से पता चलता है. इन उदाहरणों एम्स में TATS घटक मुख्य रूप से एक-नलिकाओं से बना हो सकता है, जबकि वी एम एस के व्यक्ति TATS घटक लगभग समान रूप से, टी tubules और A-नलिकाओं के बीच वितरित कर रहे हैं कि पहले की टिप्पणियों के साथ समझौते में हैं.
व्यक्ति की कोशिकाओं की TATS नेटवर्क से 8.Representative दिशात्मकता हिस्टोग्राम चित्रा. दिशात्मकता histograms AM बनाम व्यक्तिगत वीएम (ए) के skeletonized छवियों से उत्पन्न किया गया (बी इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
| छिड़काव बफर | मिमी |
| NaCl | 120.4 |
| KCl | 14.7 |
| के.एच. 2 4 पीओ | 0.6 |
| ना 2 4 HPO | 0.6 |
| 4 MgSO | 1.2 |
| HEPES | 10 |
| 3 NaHCO | 4.6 |
| Taurine | 30 |
| 2,3-Butanedione-monoxime | 10 |
| ग्लूकोज | 5.5 |
| 7.4 पीएच | |
| पाचन बफर | मिमी (निर्दिष्ट नहीं अगर) |
| NaCl | 120.4 |
| KCl | 14.7 |
| के.एच. 2 4 पीओ | 0.6 |
| ना 2 4 HPO | 0.6 |
| 4 MgSO | 1.2 |
| HEPES | 10 |
| 3 NaHCO | 4.6 |
| Taurine | 30 |
| 2,3-Butanedione-monoxime | 10 |
| ग्लूकोज | 5.5 |
| Collagenase प्रकार द्वितीय | 600 यू / एमएल |
| 7.4 पीएच | |
| बंद करो बफर | मिमी (निर्दिष्ट नहीं अगर) |
| NaCl | 120.4 |
| KCl | 14.7 |
| के.एच. 2 4 पीओ | 0.6 |
| ना 2 4 HPO | 0.6 |
| 4 MgSO | 1.2 |
| HEPES | 10 |
| 3 NaHCO | 4.6 |
| Taurine | 30 |
| 2,3-Butanedione-monoxime | 10 |
| ग्लूकोज | 5.5 |
| 2 CaCl | 0.0125 |
| गोजातीय बछड़ा सीरम | 10% |
| 7.4 पीएच | |
टेबल 1.Buffer solutआयनों. सेल अलगाव और इमेजिंग के लिए तीन अलग शारीरिक बफर समाधान की सामग्री संक्षेप हैं.
Discussion
हृदय myocytes पृथक और दशकों 32 के लिए अध्ययन किया गया है हालांकि, हाल ही में एक समीक्षा लगातार उच्च गुणवत्ता वाले myocyte सेल isolations 27 चुनौतीपूर्ण बने हुए हैं कि संपन्न हुआ. इस तुलना- की तुलना में एक आम मानक दृष्टिकोण की कमी है, साझा मेटाडाटा, और पारदर्शी सेल गुणवत्ता प्रलेखन प्राथमिक हृदय myocytes के अलगाव के लिए अपेक्षाकृत जटिल प्रोटोकॉल को दर्शाता है. सेल अलगाव प्रोटोकॉल आमतौर पर अलग अलग समूहों द्वारा अनुकूलित कर रहे हैं, सेल आइसोलेट्स की, चर परिणामों का उत्पादन व्यक्तिगत मॉडल सेटिंग्स (जैसे, प्रजाति, आयु, coexisting दिल की स्थिति) पर निर्भर करती है, और आमतौर पर विशेष प्रयोगात्मक शर्तों के लिए समायोजित कर रहे हैं. झिल्ली अध्ययन और प्रोटोकॉल यहाँ प्रस्तुत मात्रात्मक TATS, गुणवत्ता मूल्यांकन और प्रलेखन का एक आवश्यक स्तर के संदर्भ में चयापचय और अलगाव प्रोटोकॉल निर्भर परिवर्तन से ग्रस्त व्यक्ति कोशिका झिल्ली संरचनाओं के confocal या superresolution माइक्रोस्कोपी का सवाल है, दोनोंAM या वी एम में. महत्वपूर्ण बात है, सेल वियोजन की उच्च पैदावार स्वस्थ बरकरार myocytes सुझाव है, भले ही जांचकर्ताओं दस्तावेज़ और समीक्षकों के कारण के कारण विभिन्न प्रकार के विशिष्ट परिवर्तन बनाम अलगाव प्रक्रियाओं के लिए गैर विशिष्ट क्षति बनाम सतह और TATS झिल्ली अखंडता की रूपात्मक मापदंड के खिलाफ सावधानी से प्रत्येक व्यक्ति के सेल न्यायाधीश की जरूरत हस्तक्षेप के रूप में स्थितियों को नियंत्रित करने के लिए की तुलना में. हृदय सेल अलगाव के दौरान एक महत्वपूर्ण चर एक दिया collagenase बहुत की विशिष्ट गतिविधि है. Collagenase के एक नए बहुत चयन करने के लिए, कई collagenase नमूने के enzymatic गतिविधि हृदय myocyte उपज और गुणवत्ता का मूल्यांकन, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार द्वारा एक दूसरे के खिलाफ परीक्षण किया जाना चाहिए. आदर्श रूप में, collagenase के एक नए बहुत पिछले सफलतापूर्वक इस्तेमाल बहुत सारे के समान collagenase गतिविधि के साथ पहचान की है (संभव एंजाइम गतिविधियों की विस्तारित मूल्यांकन के लिए सामग्री और तरीके तालिका में "collagenase बहुत चयन उपकरण" का संदर्भ लें). टीएक साथ aken, TATS झिल्ली दृश्य की मात्रात्मक दृष्टिकोण सेल अलगाव गुणवत्ता और, इसके विपरीत, अलगाव प्रक्रियाओं की महत्वपूर्ण समीक्षा और सुधार को गति प्रदान करना चाहिए TATS माइक्रोस्कोपी द्वारा दस्तावेज के रूप में unspecific झिल्ली क्षति के लिए अग्रणी हृदय सेल isolations पर गंभीर रूप से निर्भर हैं. सेल अलगाव गुणवत्ता और TATS झिल्ली दृश्य और मात्रा का ठहराव आंतरिक रूप से जुड़े हुए हैं के बाद से, इस लेख में चर्चा प्रोटोकॉल एक सतत रणनीति के रूप में सभी प्रमुख पहलुओं को कवर किया.
एक और चुनौती है और हृदय की पढ़ाई, सेल नुकसान और / या सेल नुकसान की आम मुद्दा रोधगलन 9 निम्नलिखित पाचन समझौता उपायों जैसे, की वजह से होते हैं, अभी तक सेल अलगाव के दौरान किसी का ध्यान नहीं हवा का आवेश के बाद, संभावित अनजाने क्षति जैसे खिलाफ न्याय किया जाना चाहिए. रोगग्रस्त दिल से हृदय myocytes के अलगाव अतिरिक्त, महत्वपूर्ण सेल नुकसान के लिए नेतृत्व और सेल की पैदावार में कमी आई हो सकता है. इसलिए, COMPARसेल अलगाव और गिनती लगातार मानकीकृत प्रोटोकॉल के माध्यम से लागू कर रहे हैं अगर नियंत्रण और रोगग्रस्त दिलों के बीच अलग बरकरार कोशिकाओं की कुल संख्या का ison सार्थक हो सकता है. नतीजतन, यह सबसे अच्छा संभव myocyte सेल अलगाव गुणवत्ता को दर्शाता है जो एक उपयुक्त नियंत्रण समूह, के माध्यम से सेल अखंडता न्याय करने के लिए महत्वपूर्ण है. महत्वपूर्ण बात है, व्यक्तिगत सेल गुणवत्ता और myocytes बनाम रोगग्रस्त बनाम स्वस्थ का जीना सेल माइक्रोस्कोपी अनजाने काफी TATS झिल्ली नेटवर्क के विश्लेषण को प्रभावित कर सकते अलगाव की प्रक्रिया से क्षतिग्रस्त. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल इसलिए सेल अलगाव और अक्षुण्ण झिल्ली का जीना सेल माइक्रोस्कोपी के दौरान शारीरिक झिल्ली घटकों की अखंडता और स्थिरता पर जोर. पूरे कार्यप्रवाह इन, membran बाधित झिल्ली नलिकाओं की तरह अलगाव निर्भर झिल्ली कलाकृतियों का प्रदर्शन होगा, प्राप्त करने और क्षतिग्रस्त कोशिकाओं को छोड़कर जबकि बरकरार TATS झिल्ली घटकों की रक्षा करने के लिए एक सतत रणनीति के रूप में बनाया गया हैई blebs, और बदल TATS नेटवर्क ग़लती से आगे मात्रात्मक विश्लेषण नियंत्रण परिस्थितियों में और समझौता. इसके विपरीत, एक ही रणनीति TATS झिल्ली परिवर्तन के साथ सच रोगग्रस्त सेल बनाम सच स्वस्थ के बीच सार्थक तुलना नियंत्रण पर निर्भर है, जो TATS झिल्ली, बाधित करने की क्षमता के साथ हस्तक्षेप अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण हैं.
इसके अलावा, हम पूर्वाह्न कोशिकाओं की तकनीकी रूप से और अधिक चुनौतीपूर्ण अलगाव को प्राप्त करने के लिए प्रक्रियाओं को संबोधित. प्रगति और सुधार प्रोटोकॉल के बावजूद, यह यह वी एम एस के उच्च गुणवत्ता सेल isolations पुन: पेश करने के लिए तुच्छ और भी कम विश्वसनीय एम्स के लिए नहीं है कि जोर देना जरूरी है. इस वीएम कोशिका क्षति के एक हल्के डिग्री के कारण अपेक्षाकृत अधिक सेल सेल निलंबन में कम स्पष्ट हो सकता है, जबकि सेल अलगाव के दौरान भी छोटी त्रुटियों या विविधताओं AM सेल अलगाव की विफलता को पूरा करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं कहाँ हूँ कोशिकाओं के समग्र कम उपज की वजह से है संख्या AM की तुलना में. पूर्वाह्न कोशिकाओं सी बन सकता है के बाद सेकदम 4.3 के तहत उल्लिखित के रूप में अलगाव के बाद urved, कई ROIs के माध्यम से विश्लेषण फायदेमंद हो सकता है. सेल अलगाव कदम की एक विस्तृत प्रक्रिया के बाद हम सीधे अभिन्न झिल्ली धुंधला और confocal या वी एम एस और एम्स के लिए दोनों TATS नेटवर्क की STED superresolution इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. इन प्रोटोकॉल पहले से स्थापित मानकों के माध्यम से दोनों मात्रात्मक विश्लेषण और TATS झिल्ली का चयन करें घटकों के भेदभाव सकें. वी एम एस की तुलना में, 3 डी संगठन और एम्स में आलिंद TATS नेटवर्क के कार्यात्मक व्यवहार वर्तमान में कम समझ रहे हैं.
जीवित कोशिकाओं में छवि TATS झिल्ली प्रक्रियाओं (3.1-3.7 कदम) वाणिज्यिक confocal (सामग्री / उपकरण की तालिका) और कस्टम बनाया STED प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी 9 के साथ विकसित किए गए. फ्लोरोसेंट छवि पीढ़ी और मात्रात्मक TATS विश्लेषण के लिए माइक्रोस्कोप सेटिंग्स का अनुकूलन करने के लिए, निम्नलिखित बातों सामान्य महत्व के होते हैं:
- उद्देश्य अनुभव से, TATS झिल्ली संरचनाओं के छोटे विवरण हल सेल में गहरी कई माइक्रोमीटर ध्यान केंद्रित करते हुए उच्चतम छवि गुणवत्ता प्रदान करता है जो उद्देश्य परीक्षण करने के लिए आदेश में. कुछ confocal सूक्ष्मदर्शी यहां इस्तेमाल 63X 1.4 एनए तेल उद्देश्य के विपरीत, पानी या ग्लिसरॉल उद्देश्यों के साथ बेहतर प्रदर्शन कर सकते हैं. 100X बढ़ाई साथ उद्देश्य nanometric संकल्प 34 के लिए देखने के एक छोटे क्षेत्र से दूर व्यापार, superresolution STED माइक्रोस्कोपी के लिए उपयोग किया जाता है.
- उत्तेजना और लाभ
उत्तेजना शक्ति और डिटेक्टर लाभ के इष्टतम सेटिंग्स खुर्दबीन प्रकाश पथ, लेजर प्रदर्शन, और नमूना गुणों पर निर्भर करते हैं. आदर्श रूप में, लेजर शक्ति और लाभ डिटेक्टर की पूरी रेंज का फायदा उठाने में अभी तक छवि संतृप्ति से बचने के लिए समायोजित कर रहे हैं. वाणिज्यिक माइक्रोस्कोपी सॉफ्टवेयर संकुल आमतौर पर गतिशील रेंज के निचले और ऊपरी सीमा कल्पना है कि देखने सारणी प्रदान करते हैं. इसके अलावा, डाई विरंजन संभव सबसे कम एल रोजगार कम करने के लिएअभी भी पर्याप्त संरचनात्मक TATS झिल्ली जानकारी प्रदान करता है कि aser शक्ति. इसके अलावा, उत्तेजना शक्ति myocyte contractures और मौत के लिए अग्रणी संचयी फोटो क्षति से बचने के लिए काफी कम किया जाना चाहिए. - पिक्सेल आकार
Nyquist नमूने के साथ संगत एक पिक्सेल आकार, दिया सेटिंग्स के साथ हासिल की लगभग आधा संकल्प का प्रयोग करें. Confocal इमेजिंग के लिए 100 एनएम x 100 एनएम के एक पिक्सेल आकार भी विरंजन सीमित कर देगा, जो संगत है. Superresolution माइक्रोस्कोपी के लिए काफी छोटे पिक्सेल आकार STED माइक्रोस्कोपी 9 के लिए उदाहरण के लिए, 20 एनएम एक्स 20 एनएम किया जाता है. - वास समय
Confocal सूक्ष्मदर्शी एक औसत समारोह प्रदान करते हैं. सामान्य में, संकेत औसतन जैसे के साथ संयोजन में विरंजन से बचने के लिए कम से कम संभव पिक्सेल ध्यान केन्द्रित करना समय का उपयोग, रेखा से औसतन ≥ 8 संकेत करने वाली शोर अनुपात में सुधार होगा. - मेटा डेटा के माध्यम से लागू माइक्रोस्कोपी सेटिंग्स दस्तावेज़
कैसे करें सेटिंग्स बारTATS झिल्ली संरचनाओं की छवि विवरण, एक विशेष confocal खुर्दबीन पर सुरक्षित अनुकूलित और / या सेटिंग्स (प्रोटोकॉल मेटा डेटा) दस्तावेज थे. एक ही उद्देश्य, उत्तेजना शक्ति, लाभ, पिक्सेल आकार, पिक्सेल ध्यान केन्द्रित करना समय, और औसत के समारोह के साथ कोशिकाओं की एक (या बीच में) समूह (एस) के भीतर सभी छवियों मोल. समान इमेजिंग शर्तों कोशिकाओं के एक (या बीच में) समूह (एस) के भीतर प्रत्यक्ष तुलना और quantitation के लिए अनुमति देते हैं. - सामान्य मार्गदर्शन और सिद्धांतों और confocal माइक्रोस्कोपी के आवेदन के बारे में अधिक जानकारी के लिए जैविक Confocal माइक्रोस्कोपी (Pawley जेबी, 3 संस्करण, 2006, स्प्रिंगर विज्ञान + बिजनेस मीडिया, LLC) की पुस्तिका का संदर्भ लें.
यहाँ प्रस्तुत प्रत्यक्ष विश्लेषण रणनीतियों, TATS झिल्ली और बीमारी संबंधी परिवर्तन का वर्णन पिछले प्रकाशनों के विपरीत फूरियर transf के आधार पर मात्रात्मक रणनीति 16,17, या अप्रत्यक्ष क्षेत्रीय रणनीति के रूप में टी छोटी नली घनत्व के क्षेत्रीय कुल readouts का इस्तेमाल किया हैटी छोटी नली घटक नियमितता 7 का आकलन करने के क्रम में धारीदार झिल्ली संकेतों के ormation विश्लेषण. इसके विपरीत, यहाँ वर्णित मात्रात्मक दृष्टिकोण सीधे व्यक्तिगत TATS घटकों से संबंधित है और झिल्ली नेटवर्क गुण और A-नलिकाओं का प्रतिशत तरह विशिष्ट घटकों सहित अतिरिक्त मापदंडों के एक नंबर प्रदान कर रहे हैं. इसके अलावा, TATS नेटवर्क घनत्व आरओआई क्षेत्र के प्रति पूरे निकाला कंकाल की सामान्यीकृत लंबाई के रूप में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. तीन व्यक्ति की ट्रिपल जंक्शनों की संख्या लगातार जुड़ा छोटी नली घटकों TATS झिल्ली नेटवर्क की शाखाओं में जटिलता का एक उपाय के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. हम सबसे छोटी TATS घटकों के किसी भी विश्लेषण धुंधला प्रक्रियाओं पर निर्भर करता है कि ध्यान दें. हमारे अनुभव में, एक 50 माइक्रोन DI-8-ANEPPS समाधान के 800 μl 50,000 वीएम कोशिकाओं 9 युक्त एक सेल गोली में पूरा TATS नेटवर्क दाग के लिए पर्याप्त हैं. हालांकि, सेल गोली हृदय myocytes की एक कम संख्या में शामिल अगर, शक्तिशाली प्रतिदीप्ति डिटेक्टरों उपलब्ध हैं, और अगर सबसे छोटी झिल्ली के विवरण और मात्रात्मक परिवर्तन रुचि के हैं के बजाय समग्र TATS नेटवर्क वितरण के confocal इमेजिंग, कम डाई सांद्रता अनुभवजन्य परीक्षण के आधार पर इस्तेमाल किया जा सकता है. अंत में, वर्णित विश्लेषण के लिए लिखा एक सॉफ्टवेयर मैक्रो अलग उपचार समूहों (जैसे, ड्रग्स), सेल प्रकार के बीच तुलना के लिए विशेष रूप से उपयोगी है जो बड़े डेटासेट का विश्लेषण, सुविधाजनक बनाने के लिए छवि प्रसंस्करण कदम को स्वचालित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, वीएम बनाम हूँ ), और pathophysiological हस्तक्षेप (जैसे, रोधगलन बनाम नकली).
TATS नेटवर्क की छवि विश्लेषण के लिए, सिद्धांत चरणों का निम्न क्रम लागू किया जाता है: 1) गेंद रोलिंग पृष्ठभूमि घटाव (4.5.1) पृष्ठभूमि तीव्रता में स्थानिक विविधताओं को दूर करने के लिए; 2) स्थानीय विपरीत वृद्धि (4.5.2). 3) छवि समरेखण (4.5.3); 4) सांख्यिकीय क्षेत्र विलय (4.5.4); 5) को परिभाषितछवि binarization की दहलीज (4.5.6); कंकाल डेटा की और 6) गणना (4.5.8). फ्लोरोसेंट TATS छवियों की skeletonization दौरान एक महत्वपूर्ण कदम 6 चित्र में दिखाया छवि binarization है. जुड़े thresholding चरणों अंततः सच झिल्ली संरचनाओं पृष्ठभूमि शोर से त्रुटि से पहचान संभावित झूठी संरचनाओं बनाम अंतर्निहित TATS घटकों का प्रतिनिधित्व करने के लिए पता चला रहे हैं जो परिभाषित. द्विआधारी छवि विश्लेषण के लिए सही सीमा की पहचान confocal और superresolution माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण के लिए एक पर्याप्त उच्च संकेत करने वाली शोर (SNR) अनुपात प्रत्येक पर निर्भर करता है जो सच्चे TATS झिल्ली संरचनाओं, साथ अनुरूप होना चाहिए. इसलिए, एक पर्याप्त छवि गुणवत्ता पहली और उल्लिखित के रूप में बाद में उज्ज्वल क्षेत्र छवियों द्वारा प्रलेखन सहित व्यक्तिगत सेल गुणवत्ता के महत्वपूर्ण निर्णय के साथ संयुक्त स्थापित किया जाना चाहिए. वैकल्पिक विकल्प दिया माइक्रोस्कोप डेटा उत्पादन और / या मानसिक लिए छवि विभाजन प्रोटोकॉल अनुकूलन के लिएiological सवालों छवि deconvolution और ImageJ प्लगइन्स के रूप में उपलब्ध "Otsu" या "आईएसओ डेटा" जैसे अन्य thresholding प्रक्रियाओं में शामिल हैं. भले ही अंतिम विभाजन की प्रक्रिया का, हम छवि ओवरले द्वारा निकाले और कच्चे डेटा के बीच तुलना एक अनिवार्य गुणवत्ता नियंत्रण कदम पर विचार करें. संक्षेप में, व्यक्तिगत पृथक myocytes, intracellular TATS झिल्ली की पर्याप्त धुंधला, प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए पैरामीटर अनुकूलन, और निकाले कंकाल डेटा के ओवरले नियंत्रण की रूपात्मक और झिल्ली अखंडता सभी फ्लोरोसेंट TATS छवियों और मात्रात्मक परिणामों की गुणवत्ता के लिए योगदान देगा.
माउस से बड़ा प्रजातियों सेल अलगाव के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, प्रोटोकॉल तत्काल उचित रूप में रूपांतरित किया जा सकता है. अगले बड़ी प्रजाति के लिए, चूहे दिल एक कुंद 14 जी प्रवेशनी (बाहरी व्यास 2.1 मिमी) के साथ cannulated किया जा सकता है और / मिनट 8 मिलीग्राम पर perfused. गौरतलब है कि पुराने या रोगग्रस्त दिल भी बड़ा प्रवेशनी आकार आवश्यकता हो सकती है. जीन मेंRAL, हृदय छिड़काव जलाशय और महाधमनी के बीच या एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग निरंतर प्रवाह से एक 1 मीटर ऊंची पानी स्तंभ का उपयोग कर, लगातार दबाव जैसे द्वारा या तो आयोजित किया जा सकता है. Collagenase पाचन अंत में निरंतर प्रवाह प्रोटोकॉल से कुछ हद तक नियंत्रित किया जाएगा, जो लीक पोत बेड से अत्यधिक छिड़काव दरों के प्रमुख कोरोनरी प्रतिरोध वाहिकाओं को बाधित करेगा क्योंकि चूहों और चूहों की तरह छोटे कृंतक दिलों से सेल अलगाव के लिए निरंतर प्रवाह फायदेमंद हो सकता है. प्रवाह दर और सही केन्युलेशन की निगरानी बदल रक्त वाहिका प्रतिरोध व्यवहार के साथ हस्तक्षेप मॉडल के लिए और साथ ही सेल अलगाव प्रक्रियाओं का प्रशिक्षण के लिए फायदेमंद है, जो एक प्राथमिकता हैं, इसके विपरीत, यदि लगातार दबाव छिड़काव फायदेमंद है.
ऊपर उल्लिखित के रूप में, पर्याप्त सेल गुणवत्ता अंतर्जात झिल्ली प्रणालियों के मात्रात्मक अध्ययन के लिए बहुत महत्वपूर्ण है. हालांकि, हृदय छिड़काव और collagenase पाचन के दौरान कई कारकों करोड़ कर सकते हैंitically प्रोटोकॉल अनुकूलन या मुसीबत 27 की शूटिंग के दौरान कम करके आंका नहीं किया जाना चाहिए जो सेल अलगाव, की गुणवत्ता को प्रभावित. विशेष रूप से, एक दिया collagenase बहुत की गतिविधि अध्ययन के शेष के दौरान बनाए रखा जाना ब्याज जैसे, अटरिया या अलगाव की स्थिति स्थापित करने के लिए प्रयोगात्मक सदाशयी पढ़ाई के निष्पादन के लिए पहले निलय की विशिष्ट ऊतकों के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए. इसके अलावा, छिड़काव सेटअप के पानी की गुणवत्ता, पीएच, तापमान, अनुकूलन और सफाई contaminants और एम्बोली से अनजाने नुकसान के जोखिम को कम कर देंगे, और संभवतः अतिरिक्त कारकों सेल अलगाव के दौरान इष्टतम समस्थिति की स्थिति स्थापित करने के लिए निरीक्षण किया जा रहा है. BDM (2,3-butanedione-monoxime) मायोसिन- ATPase पार पुल का एक प्रतिवर्ती अवरोध सामान्यतः सेल isolations की पैदावार बढ़ जाती है जो हृदय की मांसपेशी छूट, बनाए रखने के लिए ऊतक विच्छेदन और पाचन के दौरान प्रयोग किया जाता है. फिर भी, जांचकर्ताओं टी की जरूरतओ BDM बंद लक्ष्य प्रभाव जैसे, कुछ शर्तों के 33 के तहत ना + / सीए 2 + विनिमय धाराओं के निषेध के लिए अग्रणी गैर विशिष्ट फॉस्फेट गतिविधियों लागू हो सकता है कि बारे में पता होना. कुछ प्रयोगों के लिए यह विषाक्त और अपेक्षाकृत महंगी cardioplegic समाधान, तथापि, जो micromolar सांद्रता में मायोसिन- के लिए एक उच्च आत्मीयता के साथ एक अवरोध के रूप में blebbistatin द्वारा BDM बदलने के लिए फायदेमंद हो सकता है और अन्य ऑफ लक्ष्य प्रभाव पड़ सकता है. आराम स्वस्थ cardiomyocytes आगे के विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए बिजली की उत्तेजना और ऐसी कोशिकाओं के अभाव में किसी भी संकुचन नहीं दिखाना चाहिए. दूसरी ओर, शारीरिक कोशिकी Ca 2 सांद्रता में बिजली की उत्तेजना के जवाब में हृदय myocyte संकुचन और छूट पर स्वस्थ नियंत्रण बनाम हृदय रोग में कार्यात्मक सेल गुणवत्ता और / या असामान्य व्यवहार का आकलन करने के लिए एक अतिरिक्त उपाय के रूप में सामान्य सिकुड़ा व्यवहार को स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कोशिकाओं.
21 के साथ ही के लिए में microtubule नेटवर्क की मात्रात्मक विश्लेषण वी एम 9 में TATS झिल्ली नेटवर्क के confocal और superresolution माइक्रोस्कोपी के लिए आवेदन कर रहा हूँ किया गया है निश्चित हृदय myocytes (नहीं दिखाया डेटा). ऐसे विभिन्न विकासात्मक चरणों में TATS झिल्ली के लक्षण वर्णन या TATS नेटवर्क से संपर्क करें कि झिल्ली जुड़े प्रोटीन या organelle संरचनाओं के विश्लेषण के रूप में प्रयोगात्मक सवालों की एक किस्म के लिए रास्ते खोल सकता है प्रोटोकॉल के इन और भविष्य अनुप्रयोगों अत्यधिक, डोमेन विशिष्ट संकेत स्थानीयकृत लागू करने के लिए AM और वीएम कोशिकाओं में कार्य करता है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals and Enzymes | |||
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | B0753 | |
| Bovine calf serum | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | SH30073 | Triple 0.1 µm sterile filtered. |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | 21115 | Diluted 1:10 in MQ water to obtain 100 mM CaCl2 stock concentration. |
| Collagenase type II | Worthington via Cell Systems, Troisdorf, Germany | on request | Enzymatic activity depends on individual collagenase batches. Collagenase II and other enzyme activities (Caseinase, Clostripain, Tryptic) can be assessed in the "collagenase lot selection tool". Determine cell yield and quality individually for each new lot of collagenase. |
| Glucose | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | HN06.1 | |
| Heparin | Rotexmedica, Trittau, Germany | PZN-03862340 | Diluted in 0.9% NaCl and injected subcutaneuosly in abdominal skin. |
| HEPES | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 9105.4 | |
| Forene 100% (V/V) | Abbott, Libertyville, IL, USA | B506 | Active agent: isoflurane, 250 ml. Use approximately 2 Vol% in air/oxygen dispenser instrument. |
| KCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6781.3 | |
| KH2PO4 | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3904.2 | |
| Laminin (2 mg/ml) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 354232 | Lamination is described under step 2.1. |
| MgCl2·6H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2189.2 | |
| MgSO4·7H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8283.2 | |
| Na2HPO4·2H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4984.2 | |
| NaHCO3 | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | HN01.1 | |
| Taurin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4721.2 | |
| Dyes | |||
| Di-8-ANEPPS | Molecular Probes, Life Technologies, Darmstadt, Germany | D-3167 | Stock solution 2 mM in DMSO |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | T8154 | Trypan blue is gently mixed 1:1 via tip-cut 1 ml plastic pipette with cell suspension prior to cell counting in Neubauer cytometer. |
| Langendorff Perfusion Setup | |||
| Circulation thermostat | Lauda, Lauda-Königshofen, Germany | Please refer to Louch et al. (JMCC 2011). Heat up thermostat und buffers in perfusion tubing to 37 °C 15 min prior to use. | |
| Flexible silicone tubing Tygon for peristaltic pump | VWR, Darmstadt, Germany | 224-2252 | Tubing needs to be changed regularly. |
| Flexible silicone tubing Tygon for thermostat | VWR, Darmstadt, Germany | 228-4340 | |
| Heating coil surroundung perfusion tubing | Rettberg, Göttingen, Germany | custom-made | Heating coil and tubing needs to be cleaned thoroughly via MQ water after using. Do not use detergents. Glass components should be bathed regularly in 10 mM NaOH overnight. |
| Peristaltic pump | Ismatec, Wertheim, Germany | ISM830 | |
| Three way stop cock Discofix C Luer Lock 10 cm | Braun, Melsungen, Switzerland | 16500C | |
| Three way stop cock Discofix 3SC | Braun, Melsungen, Switzerland | 4095146 | |
| Instruments | |||
| 42 mm glass coverslips | Menzel Gläser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany | on request | 0.13-0.16 mm thickness |
| Cannula 21 G | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lake, NY, USA | 304432 | Cut to a length of ~5 mm, roughened with sandpaper. |
| Coverslips for Neubauer cytometer 24 x 24 mm | Menzel Gläser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany | on request | 0.38-0.42 mm thickness |
| Graefe forceps, 0.5 mm tips, slight curve | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11151-10 | |
| LSM 710 NLO | Carl Zeiss, Jena, Germany | 63X 1.4 NA oil objective | |
| Neubauer improved cytometer | Labor Optik, Friedrichsdorf, Germany | 1100000 | Counting procedure: Wipe cytometer and coverslip provided with the counting chamber with 70 % ethanol. Press coverslip gently on the counting chamber so that the two glass surfaces are in contact and Newton's rings can be observed. Subsequently, 10-20 µl cell suspension can be applied to the edge of the coverslip to be sucked into the void by capillary action. Count the intact vs. defect myocytes using the squares of the cytometer grid which reflects 100 nl. Repeat counting procedure on the second grid provided on the cytometer. Calculate the density of cells in your original cell suspension by taking account of any dilutions and counting shortcuts. |
| POC-R2 Imaging Chamber | Pecon, Erbach, Germany | Cell suspension volume: 800 µl; desired plating density: ~1,000 AM and ~10,000 VM | |
| Spring scissors, 8 mm blades straight, blunt | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 15025-10 | |
| Student dumont #7 forceps, inox | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91197-00 | |
| Student iris scissors, curved, 11.5 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91461-11 | |
| Student iris scissors, straight, 11.5 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91460-11 | |
| Student surcigal scissors, straight, sharp, 12 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91402-12 | |
| Tissue forceps, 1 x 2 teeth, slim, 10 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11023-10 | |
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