العزلة، تحديد الهوية، وتنقية خلايا الفئران التوتة طلائي
Summary
نحن هنا وصف وسيلة فعالة لعزل، وتحديد، وتنقية الخلايا الظهارية الماوس الغدة الصعترية (TECS). ويمكن استخدام بروتوكول للدراسات وظيفة الغدة الصعترية التطور الطبيعي للخلايا T، خلل الغدة الصعترية، وإعادة الخلايا التائية.
Abstract
الغدة الصعترية هي جهاز حيوي لتنمية الخلايا اللمفاوية T. خلايا انسجة الغدة الصعترية، الغدة الصعترية الخلايا الظهارية (TECS) هي الحاسمة ولا سيما في مراحل متعددة من تطوير خلايا T: التزام الخلايا T، واختيار الإيجابية والسلبية الاختيار. ومع ذلك، يبقى فهم وظيفة TECS في الغدة الصعترية غير كامل. في المقالة، ونحن نقدم طريقة لعزل مجموعات فرعية من المجلس التنفيذي الانتقالي الغدة الصعترية الماوس جديدة باستخدام مزيج من اضطراب الميكانيكية والهضم الأنزيمي. طريقة تمكن خلايا انسجة الغدة الصعترية وthymocytes أن أفرجت كفاءة من خلية خلية والاتصالات مصفوفة خارج الخلية وخلايا لتشكيل تعليق خلية واحدة. باستخدام الخلايا المعزولة، multiparameter التدفق الخلوي يمكن تطبيقها على تحديد وتوصيف TECS والخلايا الجذعية. لأن TECS هي السكان الخلية نادر في الغدة الصعترية، ونحن أيضا وصف وسيلة فعالة لإثراء وتنقية TECS بواسطة المستنفدة thymocytes، نوع من الخلايا الأكثر وفرة في الغدة الصعترية. فولوجناح التخصيب خلية فرز الوقت يمكن انخفضت حتى يمكن التقليل من تلك الخسارة من بقاء الخلية خلال تنقية TECS. تنقية الخلايا هي مناسبة لمختلف التحليلات المصب مثل الوقت الحقيقي-PCR، لطخة غربية والتنميط التعبير الجيني. سوف بروتوكول تعزيز البحوث المتعلقة بالوظيفة TEC وكذلك تطوير في المختبر إعادة الخلايا التائية.
Introduction
في تطور الخلايا T في وقت مبكر، يتم تجنيد نخاع العظام الجذعية المكونة للدم المشتقة من خلية الأسلاف متعدد القدرات لقشرة الغدة الصعترية، والخضوع الالتزام T النسب وتصبح الخلايا التائية السلائف 1. في القشرة، T خلايا CD4 و CD8 السلائف النفي المزدوج (DN) thymocytes توسيع وتفرق في غير ناضج CD4 و CD8 إيجابية المزدوج (DP) thymocytes، وتشكيل مجموعة كبيرة من الأسلاف مع T متغير بدرجة كبيرة مستقبلات الخلايا 1. فقط اختر فرعية MHC المقيدة الخلايا موانئ دبي ستصبح CD4 أو CD8 إيجابية احد (SP) thymocytes، الهجرة إلى النخاع من الغدة الصعترية، وتفرق في الخلايا T الناضجة المختصة وظيفيا، وهو الحدث الذي يشار إليه اختيار إيجابية 2- 6. في المقابل، استنساخ thymocytes لصناعة السيارات في رد الفعل السلبية والخضوع الاختيار تتم إزالة عن طريق موت الخلايا المبرمج، وتحويلها إلى خلايا T التنظيمية للتسامح الذاتي، أو تحويلها إلى الخلايا الليمفاوية داخل الظهاري لأغراض غير واضحة بعد 3،7-10.
في الغدة الصعترية، خلايا انسجة الغدة الصعترية تشكل المكروية فريدة توفير إشارات لهذه مصائر مختلف T تطوير خلية 5،11،12. وتتكون خلايا انسجة الغدة الصعترية من الخلايا الظهارية الغدة الصعترية (TECS) – بما في ذلك TECS القشرية (cTECs) وTECS النخاع (mTECs)، والخلايا الجذعية، الضامة، الخلايا الليفية، الخلايا البطانية، pericytes المستمدة قمة العصبية والخلايا الوسيطة الأخرى 13-15. من بين هؤلاء، TECS حاسمة في مراحل مختلفة من تطوير خلايا T 1،2،16،17. ومع ذلك، عدم وجود وسيلة قوية لعزل TECS أعاق فهم شامل لمهامهم 16. على وجه الخصوص، cTECs، والتي تشكل شبكة ثلاثية الأبعاد المحيطة بها الأسلاف في القشرة، ضرورية لاختيار إيجابية 13،18،19 لأسباب غير واضحة حتى الان. قدمت دراسات سابقة أدلة إلى عدم التجانس ودور TECS، وتعتمد في الغالب على الأدوات الشكلية والنسيجية 13 </suع>. مؤخرا تم تناول أدوار فريدة من مجموعات فرعية من قبل المجلس التنفيذي الانتقالي النهج الوراثية في نماذج الماوس 12،20. وهناك طريقة قوية وقابلة للتكرار لعزل TECS أمر أساسي لتحقيق توصيف غير متحيز من مجموعات فرعية TEC، التقييم الكمي والنوعي للوظائف TEC، وتوضيح آليات دعم cTECs كيفية اختيار إيجابية.
نظرا لندرة TECS في الغدة الصعترية والتفاعلات ضيقة أنها تشكل في الجهاز سليمة، وقد تم عزل TECS تحديا. ويستند بروتوكول الموصوفة هنا على الاكتشافات السابقة، الكواشف المتاحة حاليا، والتقنيات، ومعرفة هيكل وتكوين انسجة الغدة الصعترية. منذ ما يقرب من عقدين من الزمن، تم الإبلاغ عن عدة إجراءات لتفصيل أنسجة الغدة الصعترية 21-27، والتي كانت تستخدم أنزيمات مختلفة أثناء عملية الهضم، بما في ذلك التربسين، كولاجيناز وDispase. الرمادي وآخرون. مقارنة تلك الانزيمات في precedure من 28 عاما، وذكرت تحسن المنهجياتالتطوير التنظيمي مع الهضم متعددة الخطوات من الكوكتيلات انزيم 29 التي أصبحت تستخدم على نطاق واسع 20،30. ومع ذلك، هذا الأسلوب ينطوي على الوقت اللازم لإعداد طويل وخطوات عملية الهضم المعقدة والنتائج في أعداد الخلايا ونسب TECS متغير نهائي حتى في نفس الفوج الفئران 29،30. قبل عدة سنوات، Liberase انزيم الصف البحوث، والتي تحتوي على تنقية عالية كولاجيناز والتي البروتيني محايد لاستخدامها في أنسجة الغدة الصعترية التفكك 30. هنا، نحن تصف القائمة على بروتوكول الهضم Liberase، مع إجراءات الفصل الميكانيكي الأمثل، ويمكن أن ينتج عددا كبيرا من TECS قابلة للحياة من الأنسجة الماوس الغدة الصعترية. .
لإثراء خلايا انسجة فصلها، استخدمت الدراسات السابقة إما التدرجات كثافة المغناطيسي أو حبة فصل 21،29. ومع ذلك، كل الطرق تؤدي شديدة فقدت السكان معين من خلايا انسجة الغدة الصعترية، وخاصة سكان cTECs 29. القضاء السامة للخلايا والتقنيات بالغسل <sتصل> 31،32 وقد استخدمت على نطاق واسع للنضوب أو فصل الخلايا الليمفاوية في مجال المناعية 12،31. بعد المقارنة بين هذه التقنيات، أنشأنا بروتوكول بالغسل الحالي للتخصيب TECS. الشرط طيف أثناء إجراء تخصيب يؤدي إلى موت الخلايا أقل وغير متحيزة وزيادة الانتعاش TEC.
تعليق خلية الغدة الصعترية معزولة وصفها في القسم 3 يمكن تطبيقها مباشرة في التدفق تحليل cytometric لتحديد وتوصيف فرعية TEC والخلايا الجذعية. يصف القسم 4 طريقة بسيطة ومفيدة لتحديد مجموعات فرعية المجلس التنفيذي الانتقالي باستخدام تدفق عداد الكريات multiparameter. يمكن للتجارب التي تسعى للحصول على cTECs تنقيته أو mTECs، والإثراء TEC وخلية فرز الإجراءات يمكن العثور عليها في القسم 5 و 6.
Protocol
Representative Results
Discussion
في البروتوكول، الخطوات الحاسمة هي إعداد خلايا انسجة الغدة الصعترية (القسم 3) وإثراء TECS (القسم 4). ويوصى بشدة أن يتم تحضير محلول أنزيم جديد في كل مرة ويتم التعامل مع الأنسجة في أقرب وقت ممكن. لالتوتة المجمعة، وتحسين حجم محلول أنزيم مطلوب تبعا لعدد من التوتة. إذا تم ترك أي …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 AI088209 (إلى KAH). كما نشكر جامعة مينيسوتا التدفق الخلوي الموارد.
Materials
| Anti-mouse EpCAM | eBioscience | XX-5791-YY* | Clone G8.8 |
| Anti-mouse MHC II | eBioscience | XX-5321-YY* | Clone M5/114.15.2 |
| Anti-mouse Ly51 | eBioscience | XX-5891-YY* | Clone 6C3 |
| UEA-1 | Vector Laboratory | FL-1061 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSRFortessa | |
| Flow cell sorter | BD Biosciences | FACSAria | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| Flow cytometry analysis software | TreeStar – Flowjo | FlowJo v7/9 | |
| *XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size. |
References
- Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. Launching the T-cell-lineage developmental programme. Nat. Rev. Immunol. 8, 9-21 (2008).
- Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
- Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nat. Rev. Immunol. 9, 833-844 (2009).
- Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).
- Takahama, Y., Takada, K., Murata, S., Tanaka, K. beta5t-containing thymoproteasome: specific expression in thymic cortical epithelial cells and role in positive selection of CD8. T cells. Curr. Opin. Immunol. 24, 92-98 (2012).
- Xing, Y., Wang, X., Igarashi, H., Kawamoto, H., Sakaguchi, N. Protein phosphatase subunit G5PR that regulates the JNK-mediated apoptosis signal is essential for the survival of CD4 and CD8 double-positive thymocytes. Mol. Immunol. 45, 2028-2037 (2008).
- Benoist, C., Mathis, D. Treg cells, life history, and diversity. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, a007021 (2012).
- Pobezinsky, L. A., et al. Clonal deletion and the fate of autoreactive thymocytes that survive negative selection. Nat. Immunol. 13, 569-578 (2012).
- Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Selection of self-reactive T cells in the thymus. Annu. Rev. Immunol. 30, 95-114 (2012).
- Xing, Y., Hogquist, K. A. T-cell tolerance: central and peripheral. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, (2012).
- Anderson, G., Lane, P. J., Jenkinson, E. J. Generating intrathymic microenvironments to establish T-cell tolerance. Nat. Rev. Immunol. 7, 954-963 (2007).
- Xing, Y., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Thymoproteasome subunit-beta5T generates peptide-MHC complexes specialized for positive selection. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 6979-6984 (2013).
- Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus. Annu. Rev. Immunol. 25, 649-679 (2007).
- Rezzani, R., Bonomini, F., Rodella, L. F. Histochemical and molecular overview of the thymus as site for T-cells development. Prog. Histochem. Cytochem. 43, 73-120 (2008).
- Rodewald, H. R. Thymus organogenesis. Annu. Rev. Immunol. 26, 355-388 (2008).
- Griffith, A. V., et al. Spatial mapping of thymic stromal microenvironments reveals unique features influencing T lymphoid differentiation. Immunit. 31, 999-1009 (2009).
- Guerder, S., Viret, C., Luche, H., Ardouin, L., Malissen, B. Differential processing of self-antigens by subsets of thymic stromal cells. Curr. Opin. Immunol. 24, 99-104 (2012).
- Hogquist, K. A., Xing, Y. Why CD8+ T cells need diversity when growing up. Immunit. 32, 5-6 (2010).
- Jenkinson, E. J., Parnell, S., Shuttleworth, J., Owen, J. J., Anderson, G. Specialized ability of thymic epithelial cells to mediate positive selection does not require expression of the steroidogenic enzyme p450scc. J. Immunol. 163, 5781-5785 (1999).
- Murata, S., et al. Regulation of CD8+ T cell development by thymus-specific proteasomes. Science. 316, 1349-1353 (2007).
- Chidgey, A. P., Pircher, H., MacDonald, H. R., Boyd, R. L. An adult thymic stromal-cell suspension model for in vitro positive selection. Dev. Immunol. 6, 157-170 (1998).
- Izon, D. J., Nieland, J. D., Godfrey, D. I., Boyd, R. L., Kruisbeek, A. M. Flow cytometric analysis reveals unexpected shared antigens between histologically defined populations of thymic stromal cells. Int. Immunol. 6, 31-39 (1994).
- Jenkinson, E. J., Anderson, G., Owen, J. J. Studies on T cell maturation on defined thymic stromal cell populations in vitro. J. Exp. Med. 176, 845-853 (1992).
- Klein, L., Klugmann, M., Nave, K. A., Tuohy, V. K., Kyewski, B. Shaping of the autoreactive T-cell repertoire by a splice variant of self protein expressed in thymic epithelial cells. Nat. Med. 6, 56-61 (2000).
- Shortman, K., Vremec, D., D’Amico, A., Battye, F., Boyd, R. Nature of the thymocytes associated with dendritic cells and macrophages in thymic rosettes. Cell. Immunol. 119, 85-100 (1989).
- Volkmann, A., Zal, T., Stockinger, B. Antigen-presenting cells in the thymus that can negatively select MHC class II-restricted T cells recognizing a circulating self antigen. J. Immunol. 158, 693-706 (1997).
- Yang, S. J., Ahn, S., Park, C. S., Choi, S., Kim, M. G. Identifying subpopulations of thymic epithelial cells by flow cytometry using a new specific thymic epithelial marker, Ly110. J. Immunol. Method. 297, 265-270 (2005).
- Gray, D. H., Chidgey, A. P., Boyd, R. L. Analysis of thymic stromal cell populations using flow cytometry. J. Immunol. Method. 260, 15-28 (2002).
- Gray, D. H., et al. Unbiased analysis, enrichment and purification of thymic stromal cells. J. Immunol. Method. 329, 56-66 (2008).
- Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin. Transl. Sci. 2, 279-285 (2009).
- Kanof, M. E. Purification of T cell subpopulations. Curr. Protoc. Immunol. 7 (Unit 7.3), (2001).
- Mage, M. G. Fractionation of T cells and B cells using panning techniques. Curr. Protoc. Immunol. 3 (Unit 3.5), (1991).
- Wekerle, H., Ketelsen, U. P., Ernst, M. Thymic nurse cells. Lymphoepithelial cell complexes in murine thymuses: morphological and serological characterization. The Journal of experimental medicin. 151, 925-944 (1980).
- Kyewski, B. A., Kaplan, H. S. Lymphoepithelial interactions in the mouse thymus: phenotypic and kinetic studies on thymic nurse cells. J Immuno. 128, 2287-2294 (1982).
- Nakagawa, Y., et al. Thymic nurse cells provide microenvironment for secondary T cell receptor alpha rearrangement in cortical thymocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 20572-20577 (2012).
- McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J. Immunol. Method. 367, 85-94 (2011).
- Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. Journal of immunological method. 385, 23-34 (2012).
