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Immunology and Infection

Phenotype के लिए उच्च throughput परख Published: August 11, 2014 doi: 10.3791/51759
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 4, 1
1Department of Veterinary Pathobiology, College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Texas A&M University, 2Department of Microbial and Molecular Pathogenesis, College of Medicine, Texas A&M University System Health Science Center, 3University of California, Irvine, 4Department of Medical Microbiology & Immunology, School of Medicine, University of California, Davis

Summary

इन विट्रो फेनोटाइप साल्मोनेला या अन्य बैक्टीरियल एसोसिएशन, आक्रमण, और उच्च throughput क्षमता के साथ phagocytic कोशिकाओं में नकल करने के लिए एक उच्च throughput परख विकसित किया गया था. विधि मेजबान रोगज़नक़ बातचीत में उनके involvements के लिए साल्मोनेला जीन पीटा उत्परिवर्ती उपभेदों का मूल्यांकन करने के लिए नियुक्त किया गया था.

Abstract

साल्मोनेला प्रजातियों जूनोटिक रोगजनकों और मनुष्यों और पशुओं 1 में खाद्य जनित बीमारियों का प्रमुख कारण होते हैं. साल्मोनेला -host बातचीत अंतर्निहित तंत्र को समझना साल्मोनेला के संक्रमण की आणविक रोगजनन स्पष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. Gentamicin संरक्षण परख उच्च throughput स्क्रीनिंग रॉ 264.7 murine मैक्रोफेज का उपयोग कर मेजबान बातचीत में साल्मोनेला enterica सीरोटाइप Typhimurium का विलोपन म्यूटेंट की भूमिका को परिभाषित करने के लिए अनुमति देने के लिए अनुकूलित किया गया था phagocytic कोशिकाओं में साल्मोनेला एसोसिएशन, आक्रमण और प्रतिकृति phenotype के लिए. इस प्रोटोकॉल के तहत विचरण जंगली प्रकार और कई उत्परिवर्ती उपभेदों एक ही संस्कृति डिश में और एक ही समय में परीक्षण किया जा सकता है क्योंकि माप में काफी मानक प्रोटोकॉल की तुलना में कम है. मल्टीचैनल pipettes का उपयोग बढ़ जाती है throughput और सटीक बढ़ाता है. इसके अलावा, चिंताओं कम हो का उपयोग करने के लिए संबंधित96 अच्छी तरह से संस्कृति डिश में अच्छी तरह से प्रति सेंट कोशिकाओं को संबोधित कर रहे थे. इधर, phagocytic कोशिकाओं का उपयोग कर संशोधित इन विट्रो साल्मोनेला आक्रमण परख के प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक एसोसिएशन, आक्रमण और intracellular नकल के लिए 38 व्यक्ति साल्मोनेला विलोपन म्यूटेंट phenotype के लिए नियुक्त किया गया था. इन विट्रो phenotypes, जिनमें से कुछ को बाद में एक पशु मॉडल में विवो phenotypes में है की पुष्टि की थी, प्रस्तुत कर रहे हैं. इस प्रकार, संशोधित, मानकीकृत परख उच्च throughput क्षमता बैक्टीरियल मेजबान बातचीत का अध्ययन करने के लिए और अधिक मोटे तौर पर उपयोग किया जा सकता है साथ मैक्रोफेज में साल्मोनेला एसोसिएशन, आक्रमण और प्रतिकृति phenotype के लिए.

Introduction

Nontyphoidal साल्मोनेला सभी रीढ़ में आंत्र रोग का महत्वपूर्ण कारण होते हैं. मानव में सलमोनेलोसिज़ शीर्ष जीवाणु खाद्य जनित रोगों 1 के बीच है. उनके पशु मेजबान के साथ साल्मोनेला की बातचीत पिन कि आणविक तंत्र की विशेषता मुख्य रूप से संक्रमण के ऊतक संस्कृति और पशु मॉडल में साल्मोनेला enterica सीरोटाइप Typhimurium (एसटीएम) के अध्ययन के माध्यम से हासिल की है. एसटीएम मेजबान बातचीत में अंतर्दृष्टि रहा हमें साल्मोनेला जीवित और मेजबान कोशिकाओं के अंदर हो जाना कैसे समझने में मदद मिलेगी. इन मुलाकातों का अध्ययन में पहली चुनौती मेजबान और रोगज़नक़ दोनों से संभव के रूप में कई भाग लेने वाले कारकों की पहचान करना है, लेकिन इन प्रयासों को बड़े पैमाने पर, एक साथ दो स्वतंत्र जटिल जैविक प्रणालियों के साथ यानी, मेजबान और साल्मोनेला निपटने के महत्वपूर्ण कठिनाइयों से बाधित कर रहे हैं, शारीरिक शर्तों के तहत. साथ ही, बड़े repertसाल्मोनेला की oire और संभावित मेजबान बातचीत में शामिल कारकों एन्कोडिंग मेजबान जीन इस चुनौती से निपटने के लिए उच्च throughput जैविक मंच की आवश्यकता होती है.

एक संशोधित, मानकीकृत परख संभावना साल्मोनेला -host बातचीत में उलझाने के जीनों का एक बड़ा सेट की जांच करने के लिए विकसित किया गया था उच्च throughput क्षमता के साथ मैक्रोफेज में साल्मोनेला एसोसिएशन, आक्रमण और प्रतिकृति phenotype के लिए. Gentamicin संरक्षण परख 1973 2 में विकसित किया गया था, लेकिन पहले अच्छी तरह से 1994 3,4 में Elsinghorst द्वारा वर्णित किया गया था. अब यह साल्मोनेला 5,6 सहित पूर्व vivo कई intracellular बैक्टीरियल रोगज़नक़ों, अध्ययन के लिए एक मानक उपकरण बन गया है. भली भाँति बैक्टीरिया कोशिकाओं 3 घुसना नहीं कर सकते हैं कि Gentamicin जैसे कुछ एंटीबायोटिक दवाओं,, द्वारा मारा जा रहा से बचने. इस घटना का लाभ लेने से, Gentamicin संरक्षण परख intracellular बीए के अस्तित्व और विकास के उपायcterial रोगजनकों. संक्रमण के दौरान तीन घटनाओं, यानी, यूकेरियोटिक कोशिकाओं, आक्रमण और प्रतिकृति के साथ मिलकर, संक्रमण, Gentamicin उपचार, और आगे ऊष्मायन (चित्रा 1) के बीच समय अंतराल पर आधारित intracellular बैक्टीरियल रोगज़नक़ों के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है. यूकेरियोटिक सेल लाइनों मेजबान रोगज़नक़ बातचीत के अध्ययन के लिए प्रासंगिक पशु मॉडलों की तुलना में कम जटिल है कि एक मनोवैज्ञानिक वातावरण प्रदान करते हैं.

Gentamicin संरक्षण परख एसटीएम मेजबान बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त मंच है, लेकिन एक 24 अच्छी तरह से संस्कृति डिश में मानक परख कम throughput क्षमता है. इन विवो डेटासेट के कम्प्यूटेशनल विश्लेषण लगभग 300 मेजबान जीन उत्पादों (अप्रकाशित डेटा) के साथ बातचीत करने के लिए भविष्यवाणी कर रहे हैं कि 149 साल्मोनेला जीन उत्पादों की पहचान की. मानक Gentamicin संरक्षण परख कुशलता म्यूटेंट की इस संख्या phenotype करने की क्षमता नहीं है.

Addit मेंआयन, Gentamicin संरक्षण परख सैद्धांतिक रूप से एक भी जीवाणु के आक्रमण का पता लगा सकते. अलग अलग समय पर दोहराया जब इस वजह निहित संवेदनशीलता की, कच्चे डेटा तकनीकी प्रसरण लिए अतिसंवेदनशील होते हैं. आंतरिक नियंत्रण और सामान्य बनाने के बाद रिश्तेदार डेटा प्रस्तुति परिणामों की सार्थक व्याख्या के लिए आवश्यक हैं. इन बातों को देखते हुए एक संशोधित, मानकीकृत Gentamicin संरक्षण परख परीक्षण क्षमता बढ़ाने के लिए और परिशुद्धता बढ़ाने के लिए विकसित किया गया था.

निम्नलिखित प्रोटोकॉल विस्तृत और 96 अच्छी तरह से संस्कृति व्यंजन और murine बृहतभक्षककोशिका RAW264.7 सेल लाइन का उपयोग कर संशोधित Gentamicin संरक्षण परख प्रदर्शन करने के लिए सचित्र है. 24 अच्छी तरह से संस्कृति बर्तन में मानक प्रोटोकॉल की तुलना में, संशोधित प्रोटोकॉल निम्न फायदे हैं: 1) 96 अच्छी तरह से संस्कृति बर्तन का प्रयोग पर्याप्त सांख्यिकीय शक्ति के साथ आंतरिक सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण सहित phenotyped होने के लिए 10 अलग अलग उत्परिवर्ती उपभेदों अप करने के लिए अनुमति देता है;उत्परिवर्ती उपभेदों एक ही संस्कृति डिश में और एक ही समय में परीक्षण कर रहे हैं क्योंकि 2) के परिणाम के विचरण काफी कम हो जाता है; ऑपरेटर थकान को कम करते हुए 3) मल्टीचैनल pipettes का उपयोग throughput बढ़ जाती है. अन्त में, 24 अच्छी तरह से संस्कृति व्यंजन की तुलना में, 96 अच्छी तरह से संस्कृति डिश में अच्छी तरह से प्रति कम मेजबान कोशिकाओं की चिंताओं प्रोटोकॉल अनुकूलन और मानकीकरण के माध्यम से संबोधित कर रहे थे.

संक्षेप में, phagocytic कोशिकाओं में इन विट्रो फेनोटाइप साल्मोनेला या अन्य बैक्टीरियल एसोसिएशन, आक्रमण और नकल करने के लिए संशोधित, मानकीकृत परख प्रेसिजन बढ़ जाती है और ऑपरेटर थकान को कम करते हुए उच्च throughput क्षमता को प्राप्त होता है.

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Protocol

1 Murine मैक्रोफेज RAW264.7 सेल संस्कृति

  1. कम बीतने संख्या murine मैक्रोफेज कोशिकाओं को विकसित, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में एक टी -75 सेल संस्कृति फ्लास्क निकाल फिल्टर कैप में RAW264.7 (ATCC ® संख्या, TIB-71) (FBS) , 0.5% 3 NaHCO, और 1% एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 100x nonessential अमीनो एसिड (NEAA),.
  2. कोशिकाओं कुप्पी में एक 60-80% संगम तक पहुँचते हैं, कोशिकाओं फसल के लिए एक सेल खुरचनी का उपयोग, और एक hemacytometer में कोशिकाओं की गिनती और सेल एकाग्रता की गणना.
  3. कोशिकाओं Resuspend और ताजा DMEM सेल संस्कृति माध्यम में 2.5 x 10 5 / एमएल में सेल एकाग्रता पतला. 96 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटों के प्रत्येक कुएं में 5 एक्स 10 4 कोशिकाओं से युक्त DMEM सेल संस्कृति के माध्यम से 200 μl थाली करने के लिए मल्टीचैनल pipettes का प्रयोग करें.
  4. प्रत्येक साल्मोनेला तनाव की चार कुओं प्लेट. एक सेट के लिए तीन अलग प्लेटों सेट करेंphagocytic कोशिकाओं आक्रमण परख की, और क्रमशः, "संघ", "आक्रमण" और "प्रतिकृति" के साथ उन्हें चिह्न.
  5. मैक्रोफेज कोशिकाओं कुओं की तह तक संलग्न करने के लिए अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में प्लेटें प्लेस.

साल्मोनेला जंगली प्रकार और म्यूटेंट के 2. तैयारी

  1. बृहतभक्षककोशिका RAW264.7 कोशिकाओं की तैयारी के एक ही दिन में, (जंगली प्रकार के एकल कालोनियों (WT) साल्मोनेला enterica सीरोटाइप Typhimurium 14028s, Luria-Bertani में DinvA उत्परिवर्ती, DphoP उत्परिवर्ती, और इच्छित परीक्षण उत्परिवर्ती उपभेदों, और संस्कृति उन्हें लेने पौंड) शोरबा के रूप में उपयुक्त एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक. 10 उत्परिवर्ती उपभेदों (DinvA उत्परिवर्ती और DphoP उत्परिवर्ती क्रमशः, आक्रमण और intracellular प्रतिकृति में दोषपूर्ण हैं) के लिए परीक्षण करने के लिए phagocytic कोशिकाओं आक्रमण assays के प्रत्येक सेट का उपयोग करें.
  2. एस के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 14 घंटे के लिए बैक्टीरिया बढ़नेएक दौर नीचे ट्यूब में शिथिल छाया हुआ 14 मिलीलीटर polypropylene में 5 एमएल लेग शोरबा में से प्रत्येक में 220 rpm पर haking. लेग शोरबा हमारे मामले में, उत्परिवर्ती उपभेदों के सबसे kanamycin लिए प्रतिरोधी रहे हैं, उचित एंटीबायोटिक दवाओं में शामिल है, 50 माइक्रोग्राम / एमएल
  3. अगले दिन, 220 rpm पर झटकों के साथ एक अतिरिक्त 4 घंटे के लिए 01:50 के अनुपात में लेग बतख के सादे 5 मिलीलीटर में साल्मोनेला उपभेदों की संस्कृतियों पर की प्रत्येक उपसंस्कृति.
  4. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर आयुध डिपो प्रत्येक जीवाणु संस्कृति की 600 मूल्यों को पढ़ने, और प्रत्येक पढ़ें साल्मोनेला pathogenicity द्वीप -1 प्रकार III स्राव प्रणाली आक्रमण के लिए (SPI-1 TTSS) जीन अभिव्यक्ति अनुकूलन करने के लिए 0.6-1.2 सीमा होनी चाहिए.
  5. 1 आयुध डिपो के सूत्र का प्रयोग 600 = 7.5 x 10 8 CFU तो, बैक्टीरियल एकाग्रता का अनुमान ताजा DMEM सेल संस्कृति माध्यम में 5 एक्स 10 6 CFU / एमएल के एक एकाग्रता के लिए बैक्टीरिया को कमजोर करने के लिए / एमएल.

96 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली में 3 आक्रमण परख

  1. तीन 96 अच्छी तरह सीईएल निकालेंएल संस्कृति सीओ 2 इनक्यूबेटर से प्लेटें और धोने के प्रत्येक अच्छी तरह 1x पीबीएस बफर के 200 μl के साथ एक बार.
  2. धोने और पीबीएस के पूरी तरह हटाने के बाद, प्रत्येक कुएं में 200 μl बैक्टीरिया DMEM मध्यम में (ऊपर देखें) जोड़ें. इस संक्रमण के प्रत्येक अच्छी तरह से और बहुलता 20 के (MOI) में 1 एक्स 10 6 साल्मोनेला कोशिकाओं में यह परिणाम है: 1.
  3. फिर 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में प्लेट (समय शून्य) की जगह, 10 मिनट के लिए एक मोहरबंद वाहक में 1,000 XG पर प्लेटें अपकेंद्रित्र. प्रत्येक तनाव के लिए, कम से कम चार डुप्लिकेट कुओं की स्थापना की.
  4. 30 मिनट के बाद, इनक्यूबेटर से प्लेटें हटाने और असंबद्ध बैक्टीरिया को दूर करने के लिए 1x पीबीएस के 200 μl के साथ तीन बार धोएं.
  5. धोने के बाद, आगे के इलाज के लिए "एसोसिएशन" के साथ लेबल थाली बचा. टी क्रम में "आक्रमण" और "प्रतिकृति" के साथ चिह्नित प्लेटों के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 100 माइक्रोग्राम / एमएल gentamicin युक्त DMEM माध्यम के 200 μl जोड़ेंओ. कोशिकी साल्मोनेला को मारने के लिए एक अतिरिक्त घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर प्लेटें लौटें.
  6. , मैक्रोफेज कोशिकाओं की संख्या की रिकॉर्डिंग के लिए प्रत्येक संक्रमित तनाव से अच्छी तरह से एक को बचाने के 10 मिनट के लिए 1% ट्राइटन X-100 युक्त 1x पीबीएस के 200 μl के साथ "एसोसिएशन" प्लेट पर कुओं के बाकी का इलाज. ट्राइटन समाधान मैक्रोफेज कोशिकाओं lyse और जुड़े साल्मोनेला जारी करेंगे.
  7. प्रत्येक अच्छी तरह से फसल साल्मोनेला और 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में उन्हें जगह है. प्रत्येक अच्छी तरह से काटा नमूनों पर 900μl 1x पीबीएस के साथ तीन 10 गुना धारावाहिक dilutions प्रदर्शन, भंवर प्रत्येक कमजोर पड़ने के बीच किया जाता है.
  8. या तो लेग (WT) या लेग कान (म्यूटेंट) प्लेटों पर तीसरे कमजोर पड़ने, 10 -3, थाली. उचित साल्मोनेला तनाव नाम, कमजोर पड़ने संख्या, समय बिंदु और तारीख के साथ प्लेटें लेबल.
  9. तीसरे कमजोर पड़ने ट्यूब vortexing के बाद, अगर और दोहराने च की सतह पर 10 μl नमूना बांटना5 बूंदों की कुल के लिए हमारे समय. पांच से 10 μl पेट्री डिश प्लेटें 7 पर समान रूप से बूँदें अंतरिक्ष के लिए सुनिश्चित करें.
  10. बूंदों के बाद, अगर में सोख अधिक प्लेटों की बारी है और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में रातोंरात सेते हैं.
  11. 10 मिनट के लिए 0.25% trypsin EDTA युक्त 150 μl 1XPBS साथ मैक्रोफेज की गिनती के लिए बचाया कुओं समझो.
  12. Trypsinization के बाद, 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में जगह मैक्रोफेज और, trypsin / EDTA समाधान बेअसर करने के लिए FBS की 50 μl के साथ उन्हें इलाज 0.4% Trypan नीले रंग के साथ कोशिकाओं दाग और hemacytometer का उपयोग कर के माध्यम से उन्हें स्कोर.
  13. एक घंटा ऊष्मायन बीत गया है जब, सीओ 2 इनक्यूबेटर से "आक्रमण" और "प्रतिकृति" प्लेटें हटाने, और "3.4 कदम 'के रूप में अच्छी तरह से प्रत्येक धोने.
  14. "चरण 3.6-3.12" के रूप में आगे के इलाज के लिए "आक्रमण" थाली बचाओ.
  15. को 10 माइक्रोग्राम / एमएल gentamicin युक्त DMEM माध्यम के 200 μl जोड़ें"प्रतिकृति" थाली माध्यम में कोशिकी साल्मोनेला की निकासी को बनाए रखने के लिए. एक अतिरिक्त 22.5 घंटे के लिए 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस, थाली लौटें.
  16. अगले दिन, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर से "प्रतिकृति" थाली हटाने, और प्रत्येक धोने के साथ ही "3.4 कदम" और "चरण 3.6-3.12" के रूप में उन्हें इलाज.
  17. अन्त में, 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रातोंरात ऊष्मायन के बाद अगर प्लेट को हटाने और बैक्टीरियल कालोनियों की संख्या स्कोर.
  18. एक अच्छा कॉलोनी वितरण कालोनियों के बीच 10 और 100, हर जगह लगभग 2 कालोनियों से 20, यह एक स्थान पर 20 से अधिक कालोनियों अगर वहाँ स्कोर करने के लिए मुश्किल होगा शामिल होना चाहिए. जरूरत के रूप में गणना बहुत कम या बहुत अधिक है, के साथ नमूना replate अधिक या कम dilutions के 10 गुना.

4 डेटा विश्लेषण

  1. चढ़ाना के आधार पर प्रत्येक प्लेट की CFU (एमएल प्रति कॉलोनी गठन यूनिट) की गणनामात्रा और कमजोर पड़ने कारक.
  2. प्रत्येक तनाव से दर्ज मैक्रोफेज कोशिकाओं की संख्या के माध्यम से मैक्रोफेज प्रति साल्मोनेला की संख्या का पता लगाएं.
  3. क्रमशः सेल एसोसिएशन, आक्रमण या प्रतिकृति, के लिए कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों से मैक्रोफेज प्रति CFU के ज्यामितीय मतलब है की गणना, और सापेक्ष मूल्य के लिए WT को आगे मानक के अनुसार.
  4. गुम्मट के लिए प्रत्येक तनाव तुलना करके, क्रमशः छात्र के टी -test द्वारा एसोसिएशन, आक्रमण, और नकल के लिए डेटा का विश्लेषण, और पी मूल्य द्वारा सांख्यिकीय महत्व का निर्धारण.

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Representative Results

डेटा संशोधित phagocytic सेल आक्रमण परख के आधार पर प्लॉट किए जाते हैं के बाद प्रतिनिधि परिणाम (चित्रा 2) देखें. डेटा प्रतिकृति 8 के लिए दोषपूर्ण हो जाना जाता पाँच अलग अलग उपभेदों, गुम्मट, ΔinvA, ΔphoP, उत्परिवर्ती ए, और आक्रमण के लिए दोषपूर्ण हो जाना उत्परिवर्ती बी Δ INVA,, और ΔphoP शामिल, प्रयोगात्मक वैधता का आकलन करने के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं . दरअसल, संशोधित आक्रमण परख में, एक ΔinvA उत्परिवर्ती RAW264.7 कोशिकाओं द्वारा खराब भाँति है और एक ΔphoP उत्परिवर्ती 24 घंटा के बाद प्रतिकृति कम था. म्यूटेंट ए और बी इस प्रोटोकॉल का उपयोग assayed प्रतिनिधि उपभेदों हैं. उत्परिवर्ती एक एक ΔphoP उत्परिवर्ती लिए इसी तरह की प्रतिकृति (चित्रा 2) के महत्वपूर्ण कमी को दर्शाता है; दिलचस्प है, उत्परिवर्ती बी प्रतिकृति में उल्लेखनीय वृद्धि (चित्रा 2) से पता चलता है. डेटा स्पष्ट रूप से उन Muta दोनों का संकेतएनटीएस मैक्रोफेज में आक्रमण और अस्तित्व के लिए phenotypes बदल दिया है.

संक्षेप में, कई साल्मोनेला विलोपन म्यूटेंट व्यक्तिगत रूप से संशोधित आक्रमण परख का उपयोग RAW264.7 मैक्रोफेज में बैक्टीरिया एसोसिएशन, आक्रमण, और नकल में लिप्त होने के लिए phenotyped गया. 38 परीक्षण म्यूटेंट के बीस अब तक मैक्रोफेज (1 टेबल), phagocytic कोशिकाओं में इन विट्रो फेनोटाइप साल्मोनेला या अन्य बैक्टीरियल एसोसिएशन, आक्रमण और प्रतिकृति परिशुद्धता और उच्च throughput क्षमता है, जबकि बढ़ जाती है को इस प्रकार संशोधित परख के जीवाणु संक्रमण में चर लेकिन महत्वपूर्ण दोषों प्रदर्शित ऑपरेटर थकान को कम करने.

चित्रा 1
उच्च throughput परख की संख्या 1 कार्य योजना. Gentamicin संरक्षण परख मोदीfied, 96 अच्छी तरह प्लेटें में एक साथ कई साल्मोनेला म्यूटेंट phenotype के लिए मानकीकृत. महत्वपूर्ण कदम RAW264.7 मैक्रोफेज कोशिकाओं में साल्मोनेला की एसोसिएशन, आक्रमण और नकल की जांच करने के लिए ऊपर के रूप में प्रदर्शन कर रहे हैं.

चित्रा 2
. गुम्मट, ΔinvA, ΔphoP, उत्परिवर्ती ए, और उत्परिवर्ती बी - - चित्रा 2 प्रतिनिधि परिणाम उच्च throughput assays साल्मोनेला उपभेदों के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं RAW264.7 मैक्रोफेज कोशिकाओं में. प्रत्येक तनाव के लिए, बृहतभक्षककोशिका प्रति CFU के ज्यामितीय साधन दिखाया गया है WT और ग्राफिक प्रतिनिधित्व करने के लिए आगे सामान्यीकृत हैं जो क्रमश: सेल एसोसिएशन, आक्रमण और प्रतिकृति, के लिए तीन स्वतंत्र प्रयोगों से प्राप्त कर रहे हैं. त्रुटि सलाखों मानक त्रुटि निरूपित, और प्रत्येक तनाव के सांख्यिकीय महत्व संदर्भितगुम्मट के लिए छात्र के टी -test द्वारा निर्धारित किया गया था. * पी <0.05. MOI 20 =.

तालिका 1
टेबल उम्मीदवार जीन की 1 phenotypes. उम्मीदवार साल्मोनेला म्यूटेंट RAW264.7 मैक्रोफेज कोशिकाओं में एसोसिएशन, आक्रमण और नकल के लिए संशोधित, मानकीकृत परख द्वारा phenotyped कर रहे हैं. 20 म्यूटेंट एसोसिएशन, आक्रमण और / या प्रतिकृति में महत्वपूर्ण दोष है.

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Discussion

Gentamicin संरक्षण परख व्यापक रूप से मेजबान सेल के अंदर intracellular बैक्टीरियल रोगज़नक़ों के आक्रमण और प्रतिकृति अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और यह विशेष रूप से जिसका आक्रमण संक्रमण 1 स्थापित करने के लिए शर्त कदम है साल्मोनेला, जैसे, रोगजनकों के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण जैविक उपकरण है. साल्मोनेला अनुसंधान समुदाय में मानक Gentamicin संरक्षण परख 24 अच्छी तरह से संस्कृति पकवान 5 में कार्यान्वित किया जाता है. 48 या यहां तक कि 96 अच्छी तरह प्लेटों के उपयोग उच्च throughput क्षमता 9 के लिए पहले चर्चा की गई है, हालांकि कोई वास्तविक प्रोटोकॉल विस्तार में प्रदर्शन किया और सफलतापूर्वक बैक्टीरियल म्यूटेंट का एक संग्रह का परीक्षण करने के लिए नियोजित किया गया है. इधर, एक संशोधित और मानकीकृत प्रोटोकॉल साल्मोनेला म्यूटेंट phenotype के लिए 96 अच्छी तरह से संस्कृति व्यंजन का उपयोग करने के लिए विकसित किया गया था. विशेष रूप से, इस प्रोटोकॉल केवल साल्मोनेला और phagocytic कोशिकाओं, के लिए परीक्षण किया गया था, इस प्रकार संशोधनों और अनुकूलन जाहिर othe के साथ आवश्यक होगा आर बैक्टीरिया या मेजबान कोशिकाओं.

Phagocytic कोशिकाओं में साल्मोनेला एसोसिएशन, आक्रमण और प्रतिकृति phenotype को संशोधित Gentamicin संरक्षण परख करने के कई फायदे हैं. सबसे पहले, 96 अच्छी तरह से संस्कृति पकवान प्रारूप करने के लिए 10 अलग अलग उपभेदों पर्याप्त पुनरावृत्ति सांख्यिकीय विश्लेषण और आंतरिक नियंत्रण के साथ एक साथ परीक्षण किया जा सकता है, उच्च throughput परीक्षण और विश्लेषण की अनुमति देता है. अलग अलग समय पर दोहराया जब दूसरा, क्योंकि परख की उच्च संवेदनशीलता की, Gentamicin संरक्षण परख के कच्चे डेटा तकनीकी प्रसरण के लिए अतिसंवेदनशील हो सकता है. इस संशोधित प्रोटोकॉल के तहत, कई उपभेदों विचरण को कम करने, प्रक्रिया में ही परिस्थितियों phenotyped कर रहे हैं. अन्त में, मल्टीचैनल pipettes का उपयोग क्षमता बढ़ जाती है और ऑपरेटर थकान को कम कर देता. मात्रात्मक, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा की बड़ी मात्रा में पैदा करते हुए नए प्रोटोकॉल तेजी phenotyping कई साल्मोनेला म्यूटेंट मदद की.

"ove_content> 96 अच्छी तरह से संस्कृति बर्तन में आक्रमण assays करने में एक चिंता का विषय कुओं इस चिंता का समाधान करने के लिए. कम यूकेरियोटिक कोशिकाओं होते हैं, और इस वजह से quantitation का समझौता किया जा सकता है, assays की एक बड़ी श्रृंखला reproducibility के अनुकूलन करने के लिए प्रदर्शन किया गया. पहले , इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया RAW264.7 मैक्रोफेज से कम 20 अंश था, और कोशिकाओं परख से पहले रात भर 96 अच्छी तरह से संस्कृति डिश में वरीयता प्राप्त थे दूसरा, MOI से 20 कम हो गया था. 1 या: नियमित रूप से 50 का इस्तेमाल किया 1 100: 1 ए MOI 20:.. 1 मैक्रोफेज के 99% स्टोकेस्टिक बिंदु के अनुसार पॉसों वितरण द्वारा गणना 10 से 30 बैक्टीरिया से संक्रमण को उजागर किया जाएगा कि यह जैविक कारकों तक ही सीमित नहीं, सोचा है कि यह सुनिश्चित करता है, सेलुलर क्षति हो सकती है . भारी जीवाणु से होता शारीरिक संपर्क 10 इसके अतिरिक्त, साल्मोनेला आक्रमण सकारात्मक उच्च MOI 11 के साथ जुड़ा हुआ है जो मैक्रोफेज की apoptosis, प्रेरित कर सकता है 20 के MOI का प्रयोग:. 1, सेलुलर damagई शायद कारण सीमित बैक्टीरिया बृहतभक्षककोशिका शारीरिक संपर्क के लिए, कम से कम होना पाया गया. तीसरा, ऊष्मायन समय अंतराल में तीन बार के अंक के लिए अनुकूलित किया गया था: संघ कोई Gentamicin के साथ 30 मिनट के लिए; 100 माइक्रोग्राम / एमएल gentamicin साथ अतिरिक्त 1 घंटा (कुल 1.5 घंटा के बाद संक्रमण) के लिए आक्रमण; 10 माइक्रोग्राम / एमएल gentamicin साथ अतिरिक्त 22.5 घंटा (कुल 24 घंटे के बाद संक्रमण) के लिए प्रतिकृति. हमारे परीक्षण में, 5 माइक्रोग्राम / एमएल gentamicin, इस प्रकार, 10% से सेल मुक्त DMEM में 100 माइक्रोग्राम भ्रूण गोजातीय सीरम (अप्रकाशित डेटा) सभी साल्मोनेला को मारने के लिए पर्याप्त है / एमएल gentamicin तेजी हत्या और 10 ग्राम सुनिश्चित करने के लिए उम्मीद होगी / एमएल gentamicin रातोंरात ऊष्मायन के लिए सेल संस्कृति माध्यम में कोशिकी बैक्टीरिया की निकासी बनाए रखना होगा में विवो, यह बछड़ा आंत उपकला कोशिकाओं 12,13 के साथ ऊतक जुड़े साल्मोनेला का पता लगाने के बारे में 15 मिनट लगते हैं;. इन विट्रो में, 30 मिनट ऊष्मायन की सूचना दी है जंगली प्रकार के लिए पर्याप्त होना 14 पर आक्रमण करने के लिए. मानक आक्रमण परख के लिए, पहले दो समय बिंदुओं के काम के बोझ धोने, धारावाहिक कमजोर पड़ने और चढ़ाना के कारण काफी तीव्र है. डिवाइस काफी ऑपरेटर की दक्षता और परिशुद्धता बढ़ जाती है क्योंकि हर बार बिंदु के लिए सटीक समय अंतराल, मल्टीचैनल pipettes का उपयोग करके हासिल की थी. इसके अलावा, नमूना चढ़ाना तकनीक, बजाय 100 μl चढ़ाना और मैन्युअल 10 μl के 5 अलग बूंदों बहुत चढ़ाना समय कम कर देता है और सटीकता बढ़ जाती है, जो अच्छी तरह से प्लेटों पर प्रत्येक दोहराने के लिए चढ़ाया गया, प्रसार की, धारावाहिक कमजोर पड़ने के बाद बदल गया था अंतिम गणना क्योंकि प्रति अच्छी तरह से 5 चढ़ाया नमूने से रन बनाए है. सामूहिक रूप से, इन अनुकूलन और मानकीकरण प्रक्रियाओं परख के reproducibility बढ़ाने, विभिन्न ऑपरेटरों बार बार अलग अलग समय पर अनुरूप परिणाम प्राप्त कर सकते हैं.

इस प्रोटोकॉल इस परख के लिए phagocytic कोशिकाओं के बजाय उपकला कोशिकाओं को रोजगारएक छोटे 96 अच्छी तरह प्रारूप में. सलमोनेलोसिज़ के रोगजनन अध्ययन में, सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल उपकला कोशिका लाइन विषम मानव उपकला कोलोरेक्टल ग्रंथिकर्कटता से निकाली गई, Caco -2 है. Caco -2 कोशिकाओं के साथ नियमित रूप से 24 अच्छी तरह से संस्कृति पकवान आक्रमण परीक्षण का उपयोग कर, हर समय बिंदु पर बरामद बैक्टीरिया की वास्तविक संख्या, phenotyping नकल के लिए विशेष रूप से 22.5 घंटा समय बिंदु, जब की तुलना में बहुत कम है ऐसे J774 या RAW264 रूप phagocytic कोशिकाओं, .7 मैक्रोफेज, (अप्रकाशित डेटा) किया जाता है. इस प्रकार, यह इसे और अधिक कठिन प्रत्येक अच्छी तरह से कम मेजबान कोशिकाओं है जब एक 96 अच्छी तरह से संस्कृति पकवान का उपयोग phenotyping प्रदर्शन करने के लिए बनाता है. यह मैक्रोफेज कोशिकाओं को सक्रिय रूप से अधिक बैक्टीरिया भली भाँति किया जा रहा करने के लिए ले जा सकता है, जो बैक्टीरिया, अपनी चपेट में ले सकता है कि जाना जाता है, और यह भी साल्मोनेला जाहिरा तौर पर Caco -2 कोशिकाओं में अधिक धीरे दोहराने कि संभावना से इनकार नहीं किया जा सकता. जीवित और अंदर मैक्रोफेज कोशिकाओं को दोहराने के लिए साल्मोनेला की क्षमता के रोगजनन में महत्वपूर्ण भूमिका से संबंधित हैसलमोनेलोसिज़, यानी, बड़े पैमाने पर मेजबान सूजन प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर और प्रणालीगत संक्रमण 1 की सुविधा. हम मुख्य रूप से मेजबान बातचीत में उनके संभावित कार्यों के लिए गणना पाइपलाइन चयनित जीन का एक बड़ा सेट phenotype करने के लिए संशोधित और मानकीकृत Gentamicin संरक्षण परख कार्यरत हैं. यह साल्मोनेला म्यूटेंट का लगभग 50% phagocytic कोशिकाओं में intracellular प्रतिकृति में शामिल जीनों के रूप में phenotyped गया निकला.

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Acknowledgments

यह परियोजना (ए जे बी और एलजीए, R01 AI076246 के लिए) स्वास्थ्य NIAID के राष्ट्रीय संस्थानों के लिए एक अनुदान द्वारा आंशिक रूप से समर्थन किया था. साल्मोनेला उत्परिवर्ती संग्रह आंशिक राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान के संस्थानों (एम एम के लिए, U01 A152237-05, R01 AI07397-01, R01 AI039557-11 और R01 AI075093-01) पड़ना, R21 के लिए आंशिक रूप से स्वास्थ्य अनुदान के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा, (द्वारा समर्थित किया गया AI083964-01, 1R0 1AI083646-01, 1R56AI077645, R01 AI075093). हम प्रतिकृति चढ़ाना और संग्रह में म्यूटेंट की पुष्टि के लिए स्टीफन Prowollik धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies 11965
Fetal bovine serum HyClone SH30910.03
T-75 Cell culture flask vented filter cap Nest Biotechnology 708003
100x Non-Essential Amino Acids Life Technologies 11140
Cell scraper BD Falcon 353086
96-well Cell culture plate Corning Incorporated 3595
Luria-Bertani (LB) broth MP Biomedicals 3002-075
14 ml Polypropylene Round-Bottom Tube BD Falcon 352059
PBS pH 7.4 (1x) Life Technologies 10010
Triton X-100 Sigma T-8787
Kanamycin solution Sigma K0254
Gentamicin solution Sigma G1272
0.25% Trypsin-EDTA Life Technologies 25200
Trypan blue Sigma T8154

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References

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संक्रामक रोग अंक 90, एसोसिएशन आक्रमण प्रतिकृति phenotype intracellular रोगजनकों मैक्रोफेज
Phenotype के लिए उच्च throughput परख<em&gt; साल्मोनेला enterica</em&gt; Typhimurium एसोसिएशन, आक्रमण, और मैक्रोफेज में प्रतिकृति
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Wu, J., Pugh, R., Laughlin, R. C.,… More

Wu, J., Pugh, R., Laughlin, R. C., Andrews-Polymenis, H., McClelland, M., Bäumler, A. J., Adams, L. G. High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages. J. Vis. Exp. (90), e51759, doi:10.3791/51759 (2014).

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