Cell Analyzer basados en impedancia Real-Time como una herramienta para delinear vías moleculares implicadas en la neurotoxicidad y neuroprotección en una línea celular neuronal
Summary
Improved in vitro neurotoxicity assays would aid the identification of new neuroprotective compounds. The utility of a real-time impedance-based cell analyzer to determine cytotoxicity and cytoprotection in neuronal cell lines and to delineate the involvement of second messenger pathways, thus gaining insight in the mechanism of neuroprotection is presented.
Abstract
Muchos trastornos relacionados con el cerebro tienen la muerte celular neuronal implicado en su fisiopatología. Mejora en modelos in vitro para estudiar los efectos neuroprotectores o neurotóxicos de las drogas y las vías descendentes involucradas ayudaría a aumentar el conocimiento sobre los mecanismos moleculares de neuroprotección / neurotoxicidad y potencialmente podría facilitar el desarrollo de fármacos. Sin embargo, muchos ensayos de toxicidad in vitro existentes tienen limitaciones importantes – más evaluar la neurotoxicidad y neuroprotección en un solo punto de tiempo, no permitiendo observar la evolución temporal y la cinética del efecto. Además, la oportunidad de recoger información sobre las vías de señalización corriente abajo implicados en la neuroprotección en tiempo real sería de gran importancia. En el protocolo actual se describe el uso de un tiempo real basados en la impedancia analizador de células para determinar los efectos neuroprotectores de la serotonina 2A (5-HT 2A) agonistas del receptor en una línea celular neuronal menores de etiqueta libre y en tiempo real Conditiones utilizando mediciones de impedancia. Además, se demuestra que los inhibidores de las vías de segundo mensajero se pueden utilizar para delinear las moléculas de aguas abajo implicadas en el efecto neuroprotector. También se describe la utilidad de esta técnica para determinar si un efecto sobre la proliferación celular contribuye a un efecto neuroprotector observado. El sistema utiliza placas microelectrónicos especiales denominados E-planchas que contienen alternando microelectrodos de oro en la superficie inferior de los pozos, que sirven como sensores celulares. La lectura de impedancia se modifica por el número de células adherentes, la viabilidad celular, la morfología y la adhesión. Un parámetro adimensional llamado Índice de Células se deriva de las mediciones de impedancia eléctrica y se utiliza para representar el estado celular. En general, el tiempo real basados en la impedancia analizador de células permite en tiempo real, la evaluación de la etiqueta libre de la neuroprotección y la neurotoxicidad, y la evaluación de la implicación de las rutas segundo mensajero, contribuyendo a másevaluación detallada y de alto rendimiento de potenciales compuestos neuroprotectores in vitro, para la selección de candidatos terapéuticos.
Introduction
La muerte celular neuronal desempeña un papel fundamental en la fisiopatología de muchos trastornos relacionados con el cerebro 1. La disponibilidad de información confiable y de alto rendimiento en los ensayos de toxicidad in vitro es fundamental para tener un mejor conocimiento de los mecanismos de neurotoxicidad y para ayudar a seleccionar moléculas neuroprotectoras como candidatos terapéuticos en el desarrollo de fármacos 2. Sin embargo, hay muchas limitaciones a la mayoría ampliamente utilizado en assays.They neurotoxicidad vitro evaluar la neurotoxicidad / neuroprotección en un solo punto de tiempo no permitir la resolución cinética; a menudo utilizan etiquetas o sonda que puede interferir con las vías de señalización y limitar los estudios adicionales en la misma población de células, y son a menudo mano de obra, y en muchos casos no proporcionan una visión mecanicista. En el presente estudio se demuestra la utilidad de un tiempo real basados en la impedancia analizador de células para determinar la neurotoxicidad y neuroprotección en una línea celular neuronal en tiempo real y bajo libre de etiquetascondiciones y para proporcionar información sobre los mecanismos descendentes a través del análisis de las vías de segundos mensajeros involucrados en el efecto.
Estudios previos han confirmado la validez del analizador de células en tiempo real para determinar la citotoxicidad así como los efectos sobre la proliferación celular en líneas celulares en comparación con las técnicas estándar 3,4,5,6. Por ejemplo, se observó una buena correlación entre las lecturas de la viabilidad celular WST-1 ensayo estándar y los valores de índice de células en varios puntos de tiempo bajo condiciones de proliferación basal y después de dos paradigmas diferentes tóxicos en células HeLa 3. En las células A549 y MDA-MB-231 proliferación y citotoxicidad provocado con el estabilizador de microtúbulos paclitaxel mostraron valores muy similares cuando evaluada por mediciones del índice de la célula y de la forma estándar utilizado sulforrodamina B (SRB) de ensayo 4. En la línea celular neuronal de las neuronas del hipocampo inmortalizadas HT-22 Cell mediciones de índice fueron validados por su capacidad to detectar la proliferación celular, la citotoxicidad glutamato y citoprotección contra el ampliamente utilizado de 3 (4,5-dimetiltiazol-2-il) 2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) 5. En el mismo estudio, los resultados del ensayo de MTT y las mediciones de índice de la célula también una buena correlación en la medición de la proliferación de las células progenitoras neuronales, citotoxicidad después de la privación de factores de crecimiento y de rescate de la citotoxicidad por el pan-caspasa inhibidor QVD 5. Inducida en células NIH 3T3 por vandetanib (receptor del factor de crecimiento endotelial vascular y el inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico) Citotoxicidad mostró resultados similares medidos con los valores de índice de la célula o ensayo de captación de rojo neutro 6.
Recientemente, hemos utilizado el sistema analizador de células en tiempo real para evaluar los efectos neuroprotectores de la serotonina 2A (5-HT 2A) agonista del receptor de clorhidrato de (±) -2,5-dimetoxi-4-iodoamphetamine (DOI) en una línea celular neuronal ( células SK-N-SH) y se seleccionaron para la participación de second vías de mensajería a través de monitorizar el efecto de la inhibición química de la neuroprotección observada 7. Curiosamente, el receptor 5-HT 2A tiene agonistas tanto alucinógenas y no alucinógeno (como DOI y lisurida, respectivamente), que pueden activar las dos vías de segundos mensajeros comunes y distintas 8.
Las ventajas de la técnica presentada son que permite recoger información en tiempo real sobre la supervivencia celular en el transcurso de días, para delinear las vías de segundos mensajeros implicados, para evaluar la posible contribución de los efectos de proliferación a la neuroprotección, y para seleccionar un tiempo óptimo para estudios de punto final adicionales en la misma población de células. Un diagrama esquemático del flujo de trabajo en el protocolo actual se presenta en la Figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo actual presenta la utilidad de un analizador de células en tiempo real para evaluar de manera continua y en condiciones de etiqueta libre de los efectos neuroprotectores / neurotóxicos de compuestos en líneas de células neuronales y para profundizar en los segundos mensajeros vías implicadas en el efecto.
A pesar de que la utilidad del analizador de células en tiempo real para estudiar la citotoxicidad y efectos de las drogas sobre la proliferación celular es generalmente…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financial support for the experiments presented in the study was provided by the Marie Heim-Vögtlin program of the Swiss National Science Foundation.
We thank Ms. Johanna Nyffeler for developing a set of modified MATLAB programs for screening for statistically significant differences in real-time cell analyzer’s data and Dr. Yama Abassi for helpful discussion.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| xCELLigence RTCA SP system bundle | ACEA Biosciences | No: 00380601030 | consists of RTCA Analyzer, RTCA SP Station and RTCA Control Unit |
| E-plate 96 | ACEA Biosciences | No: 05232368001 | for culturing the cells, inserted in the RTCA SP Station |
| SK-N-SH cells | ATCC – (in partnership with LGC Standards) | HTB-11 | can be replaced by another adherent neuronal cell line of interest |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D8437 | cell culture medium |
| fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-063 | supplements proliferation, but not serum deprivation medium |
| tisue culture flask T175 | Sarstedt | 83.1812.302 | for culturing cells, which will be later plated on the E-Plate 96 |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | for trypsinization of cells cultured in tissue culture flasks |
| Scepter 2.0 cell counter | Merck Millipore | PHCC20060 | automated cell counter |
| phosphate-buffered saline | Life Technologies | 10010-015 | for washing the cells |
| (±)-DOI hydrochloride | Sigma-Aldrich | D101 | 5-HT2A agonist for cell culture treatment |
| LY-294,002 hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9908 | PI3-K inhibitor for cell culture treatment |
| lisuride maleate | Tocris Bioscience | 4052 | compound with 5-HT2A agonistic activity for cell culture treatment |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | for dissolving LY-294,002 and lisuride maleate |
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