물에서 바이러스 농도에 대한 작은 볼륨 절차
Summary
An approach was developed for identifying optimal viral concentration conditions for small volume water samples using spikes of human adenovirus. The techniques described here are used to identify concentration parameters for other viral targets, and applied to large-scale viral concentration experimentation.
Abstract
Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to identify optimal parameters for virus concentration. Viruses can be concentrated from water using filtration (electropositive, electronegative, glass wool or size exclusion), followed by secondary concentration with beef extract to release viruses from filter surfaces, and finally tertiary concentration resulting in a 5-30 ml volume virus concentrate. In order to identify optimal concentration procedures, two different electropositive filters were evaluated (a glass/cellulose filter [1MDS] and a nano-alumina/glass filter [NanoCeram]), as well as different secondary concentration techniques; the celite technique where three different celite particle sizes were evaluated (fine, medium and large) followed by comparing this technique with that of the established organic flocculation method. Various elution additives were also evaluated for their ability to enhance the release of adenovirus (AdV) particles from filter surfaces. Fine particle celite recovered similar levels of AdV40 and 41 to that of the established organic flocculation method when viral spikes were added during secondary concentration. The glass/cellulose filter recovered higher levels of both, AdV40 and 41, compared to that of a nano-alumina/glass fiber filter. Although not statistically significant, the addition of 0.1% sodium polyphosphate amended beef extract eluant recovered 10% more AdV particles compared to unamended beef extract.
Introduction
인간의 장내 바이러스는 수 인성 질병에 1-3의 중요한 원인이 요원하지만, 농도없이 자신의 검출이 어려워 일반적으로 오염 된 환경 바다에서 낮은 숫자에 존재한다. 바이러스를 농축하는데 사용 된 절차는 일반적으로 필터 용출액 여과 필터 뒤에 용출 단계, 및 보조 농도를 포함한다. 일반적인 여과 절차 (최근 4,5 검토) 등 전기 양성 필터와 같은 충전 세포막의 사용에 의존한다. 이 필터는 필터 표면 (양전하)과 대상 바이러스 입자 사이의 정전 기적 상호 작용을 사용하여 물에 현탁 바이러스를 캡처에 의존 (음전하). 시판되는 두 전성 필터가이 기술에 의존하는, 유리 / 셀룰로오스 나노 알루미나 / 유리 섬유 필터. 유리 / 셀룰로오스 필터 비용이 유리 (/ CE)의 사용을 제한하는 최대 10 배 나노 알루미나 / 유리 섬유의, 아르일상 바이러스 모니터링을위한 llulose 필터. 최근 연구에 싼 필터 대안의 사용을 정당화 차이가 주변 물 6,7에서 엔테로 바이러스의 회복이 두 필터 사이의 공칭 결론을 내렸다. 이러한 전성 유리 양모 필터와 같은 다른 필터 옵션 그러나, 그들은 하나의 소스 물 (전기 음성 필터)의 전처리가 필요하거나 (유리 양모 필터) 상업적으로 사용할 수 없습니다, 연구되고있다. 바이러스 농도 절차의 개발은 주로 물에서 바이러스 회수율을 향상시키기 위하여 기본 농도 기법 (필터)의 최적화에 초점을 맞추고있다. 그러나 볼륨 밀리리터 전형적으로 1 L로부터 얻은 용출액 부피를 감소 이차 농도 절차는 또한 바이러스 회수율 8에 상당한 영향을 미칠 수있다.
장용성 바이러스의 농도는 일반적으로 보조 소고기 추출물 일부 유형으로 응집제에 의존 (유기 floccu만큼은) 또는 무 지방 우유 응집 9-12 필터 표면에서 바이러스 입자를 제거합니다. 최근, 셀 라이트 (미세 입자)의 첨가와 결합 쇠고기 추출물을 사용하여 다른 농도 차 절차는 아데노 바이러스, 장내 바이러스, 및 노로 8,13,14의 회수 가능성을 보여 주었다. 이 바이러스 입자에 유기 응집 방법과 유사한 원리 하에서 셀 라이트 농도 작품에 부착 및 현탁액의 pH를 변경하여 입자 (플록 또는 셀 라이트)로부터 방출된다. 이 두 차의 농도 기술 사이의 비교가 아군 아데노 바이러스 (ADV) 유형 40, 41 (8)의 회복으로 평가되고있다.이 연구는 두 개의 보조 농도 기술은 아데노 바이러스의 복구에 통계적으로 차이가 없었다 결론을 내렸다. 그러나, 유기 응집 방법은 30 분을 필요로한다. pH가 3.5에서 배양, 셀 라이트 기술은 pH가 4.0에서 짧은 배양 (10 분)을 필요로한다. 유기 flocculat이온도 급 농도 중에 플록 입자를 수집 비싼 실험 장비 (원심)의 사용을 필요로, 반대로 셀 라이트 기술은 현탁액으로부터 셀 라이트 입자를 분리하는 기본적인 실험 장비 (진공 여과)를 사용한다.
필터와 이차 용출 기술 특정 조합은 또한 바이러스 회수율에 영향을 미칠 수있다. 한 연구는 주 (전기 양성 필터)의 특정 조합 및 보조 농도 기술 (셀 라이트 또는 유기 응집이) 아데노 바이러스 (13)의 회복에 상당한 영향을 미쳤다 결론을 내렸다. 이러한 연구 결과는 이러한 기술을 사용할 때 그 최적화가 최적으로 주어진 물 행렬로부터 대상 바이러스를 회수하기 위해 필요한 제안한다. 최적화는 여러 변수 (필터 유형 / 브랜드, 산도 용출 용액, 셀 라이트 / 유기 응집을) 평가되기 때문에, 힘든 과정을 많은 연구자들이 적극적으로 방지 걸리는 시간입니다.
이 초간각 바이러스 유형 고유 캡시드 형태 및 특정 캡시드 전하 보여주는데 tudy이 절차는 아마도 아군 인간 아데노 바이러스를 40 균주 41 이용한 물에서 바이러스 농도에 대한 최적의 조건을 식별하기 위해 개발되었다 농도 프로토콜은 모든 바이러스에 대해 최적화 될 필요가있다 최적 바이러스 복구를 달성하기 위하여 대상. 1) 전기 양성 필터 2 다음에 디스크) 보조 농도 셀 라이트 기술에 비해 설립 유기 응집 방법의 평가를 사용하여 수돗물의 바이러스 복구를 평가, 그리고 3) 평가 :이 연구는 ADV (40)에 의해 41 농도에 대한 접근 방법을 제공합니다 차 농도에 대한 용출 버퍼.
Protocol
Representative Results
Discussion
전기 양성 필터는 물에서 바이러스를 집중에 유용하다; 그러나 이러한 필터는 다시 자신의 효과를 변경할 수있는 그들의 구조와 구성이 다를 수 있습니다. 이 문제를 복잡하게, 캡시드 구조와 요금 농도 기술은 최적의 복구 (15)을 보장하기 위해 맞출 필요 바이러스 균주에 따라서 다릅니다. (예를 들어, 전기 양성 필터, 쇠고기 추출물 용출), 대상 바이러스의보다 효과적인 농도 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Nicholas J. Ashbolt and Dr. G. Shay Fout for their review of the manuscript.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Adenovirus 40 stock | ATCC | VR-931 | |
| Adenovirus 41 stock | ATCC | VR-930 | |
| Sodium Thiosulfate | Fluka Chemical Co. | 72051 | |
| Celites #577 | Fluka Chemical Co. | 22142 | |
| NanoCeram 47mm | Argonide | N/A | |
| 1MDS 47mm | 3M | 6408502 | |
| AP-20 Prefilter 47mm | Millipore Corp. | AP2004700 | |
| Glycine | Sigma | 50046-1KG | |
| Sodium Polyphosphate | Acros Organics | 390930010 | |
| Trypsin | Gibco | 25200 | |
| PBS | Sigma | P5368 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A481-212 | |
| BBL Beef Extract | BD Biosciences | 212303 | |
| Difco Beef Extract | BD Biosciences | 211520 | |
| ABI 7900 Real-time PCR system | ABI | N/A | |
| Stainless Steel Filter Housing | Millipore Corp. | XX2004720 | |
| Blood DNA Extraction Kit | Qiagen | 51104 | |
| EPA MPN Calculator | http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html |
References
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