Summary

水からのウイルス濃度のため、小容量の手順

Published: February 03, 2015
doi:

Summary

An approach was developed for identifying optimal viral concentration conditions for small volume water samples using spikes of human adenovirus. The techniques described here are used to identify concentration parameters for other viral targets, and applied to large-scale viral concentration experimentation.

Abstract

Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to identify optimal parameters for virus concentration. Viruses can be concentrated from water using filtration (electropositive, electronegative, glass wool or size exclusion), followed by secondary concentration with beef extract to release viruses from filter surfaces, and finally tertiary concentration resulting in a 5-30 ml volume virus concentrate. In order to identify optimal concentration procedures, two different electropositive filters were evaluated (a glass/cellulose filter [1MDS] and a nano-alumina/glass filter [NanoCeram]), as well as different secondary concentration techniques; the celite technique where three different celite particle sizes were evaluated (fine, medium and large) followed by comparing this technique with that of the established organic flocculation method. Various elution additives were also evaluated for their ability to enhance the release of adenovirus (AdV) particles from filter surfaces. Fine particle celite recovered similar levels of AdV40 and 41 to that of the established organic flocculation method when viral spikes were added during secondary concentration. The glass/cellulose filter recovered higher levels of both, AdV40 and 41, compared to that of a nano-alumina/glass fiber filter. Although not statistically significant, the addition of 0.1% sodium polyphosphate amended beef extract eluant recovered 10% more AdV particles compared to unamended beef extract.

Introduction

人間の腸内ウイルスは、水系感染症1-3の重要な原因物質であるが、濃度のないそれらの検出を困難にし、一般的に汚染された環境水中の低い数で存在する。ウイルスを濃縮するために使用される手順は、典型的には濾過フィルター溶出したステップ、およびフィルタ溶出液の二次濃縮を含む。一般的な濾過手順は、そのような電気陽性フィルター(最近4,5にレビュー)のような荷電膜の使用に依存している。これらのフィルタは、フィルタ表面との間の静電相互作用(正に荷電)、および標的ウイルス粒子(負に帯電した)を使用して水に懸濁させたウイルスを捕捉するに依存する。市販されている二つの陽性のフィルタは、この技術は、ガラス/セルロース、ナノアルミナ/ガラス繊維フィルターに依存している。ガラス/セルロースフィルターのコストは、ガラス/ CEの使用を制限するナノアルミナ/ガラス繊維の最大10倍であるルーチンウイルス監視のためのフィルタをllulose。最近の研究では、違いが安く、フィルタの代替の使用を正当化する、周囲の水の6,7からのエンテロウイルスの回復にこれら二つのフィルタの間に、公称である結論に達した。そのような電気陰性及びグラスウールフィルタのような他のフィルタオプションが、それらはいずれかの源水(電気陰性フィルタ)の前処理を必要とするか、または(グラスウールフィルタ)市販されていない、研究されている。ウイルス濃縮手順の開発は、主に水からのウイルス回収率を向上させるために一次濃縮技術(フィルタ)を最適化することに焦点を当ててきた。しかし、ボリュームミリリットルため、典型的には1 Lから溶離剤の量を減少させる二次濃縮手順は、また、ウイルスの回収8に重大な影響を与えることができる。

腸内ウイルスの二次濃度は、典型的には、牛肉エキス、いくつかのタイプとして凝集剤(有機floccuに依存しています設置と)またはスキムミルク凝集9-12フィルタ表面からウイルス粒子を除去する。最近、セライト(微粒子)を添加して結合された牛肉エキスを使用して別の二次濃縮手順は、アデノウイルス、エンテロウイルス、およびノロウイルス8,13,14を回収するための有望性を示している。セライト濃度に付着し、懸濁液のpHを変化させることによって、粒子(フロックまたはセライト)から放出されるウイルス粒子中の有機凝集法と同様の原理で動作します。これら二つの二次濃縮技術との比較は、スパイクアデノウイルス(のAdV)タイプ40及び41 8の回復に評価されてきた。本研究では、2つの二次濃縮技術は、アデノウイルスの回復の統計学的に類似していたと結論付けた。しかし、有機凝集法は、30分を要する。 pH3.5でのインキュベーション、セライト技術はpH4.0で短いインキュベーション(10分)を必要とする。有機flocculatイオンはまた、コントラストセライト技術が懸濁液からセライト粒子を分離するために、基本的な実験装置(減圧濾過)を使用して、第三級濃縮中フロック粒子を収集するために、高価な実験装置(遠心分離機)の使用を必要とする。

フィルタおよび二溶出技術の特定の組み合わせはまた、ウイルス回収率に影響を与えることができる。ある研究では、プライマリ(電気陽性フィルタ)の特定の組み合わせと二次濃縮技術(セライトまたは有機凝集)はアデノウイルス13の回復の重要な影響を与えたと結論付けた。これらの知見は、最適化は、これらの技術を使用する場合に最適に与えられた水マトリックスから標的ウイルスを回収するために必要とされることを示唆している。最適化は、非常に多くの変数が(フィルタータイプ/ブランド、pH溶出液、セライト/有機凝集)が評価されるため、多くの研究者が積極的に避ける時間のかかる、骨の折れるプロセスです。

これはsのtudy、手順は、スパイク、ヒトアデノウイルスを用いて水からのウイルス濃度の最適条件を同定するために開発されたおそらく40,41菌株、各ウイルスタイプはユニークなカプシド形態および特定のキャプシド電荷を表示するので、濃度プロトコルは、すべてのウイルスのために最適化する必要があるかもしれない最適なウイルスの回復を達成するために、標的とする。 )二次濃縮、および3としての評価1)2、続いて陽性フィルターディスクを用いて水道水にウイルス回収率を評価する)、セライト技術に対する確立された有機凝集法の評価:この研究は、バイのAdV 40,41濃度ためのアプローチを提供三次濃度の溶出バッファー。

Protocol

ガラス製品とフィルターハウジングの調製特に断りのない限り、15分間121℃で、すべてのガラス製品、フィルターハウジングとソリューションを滅菌する。無菌性を確保するために、滅菌前にアルミ箔またはテープで保護された紙のいずれかですべての開口部または露出した表面を覆う。 1Lのサイドアームの三角フラスコに、フィルタハウジング(直径47mm?…

Representative Results

セライトの選択セライトの3つの異なるタイプの前最高のパフォーマンス変異体の選択に試験した。中サイズの粒子に罰金セライトは、最高のアデノウイルスの回収を生産した。大きなセライトの使用はAdV40 41(範囲32%-100%)( 図1)の両方の回収率の低下をもたらした。アデノウイルス40の平均回収率は115%±28%の(中)と82%±53%で(大)粒子セラ?…

Discussion

陽性のフィルタは、水からのウイルスを濃縮するのに有用である。しかし、これらのフィルタは、順番にそれらの有効性を変えることができ、その構造と組成が異なることができる。この問題を配合、カプシド構造と料金は、最適な回復15を確保するように調整することが濃縮技術を必要とするウイルス株の間で変動する。既存の濃縮技術( 例えば、電気陽性フィルタ、牛肉?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank Dr. Nicholas J. Ashbolt and Dr. G. Shay Fout for their review of the manuscript.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Adenovirus 40 stock ATCC VR-931
Adenovirus 41 stock ATCC VR-930
Sodium Thiosulfate Fluka Chemical Co. 72051
Celites #577 Fluka Chemical Co. 22142
NanoCeram 47mm Argonide N/A
1MDS 47mm 3M 6408502
AP-20 Prefilter 47mm Millipore Corp. AP2004700
Glycine  Sigma 50046-1KG
Sodium Polyphosphate Acros Organics 390930010
Trypsin Gibco 25200
PBS Sigma P5368
Hydrochloric Acid Fisher A481-212
BBL Beef Extract BD Biosciences 212303
Difco Beef Extract BD Biosciences 211520
ABI 7900 Real-time PCR system ABI N/A
Stainless Steel Filter Housing Millipore Corp. XX2004720
Blood DNA Extraction Kit Qiagen  51104
EPA MPN Calculator http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html

References

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Cite This Article
McMinn, B. R., Korajkic, A. A Small Volume Procedure for Viral Concentration from Water. J. Vis. Exp. (96), e51744, doi:10.3791/51744 (2015).

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