الجيل المقبل من تسلسل خاص بالريبوسوم 16S RNA جين Amplicons
Summary
Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.
Abstract
أحد الأسئلة الرئيسية في علم البيئة الميكروبية هو "من هناك؟" يمكن الإجابة على هذا السؤال باستخدام أدوات مختلفة، ولكن واحدة من معايير الذهب طويلة الأمد هو تسلسل amplicons 16S RNA الريباسي (الرنا الريباسي) الجينات التي تولدها مستوى المجال PCR ردود الفعل من تضخيم الحمض النووي الجيني. تقليديا، تم تنفيذ ذلك عن طريق الاستنساخ وسانجر (الكهربائي الشعرية) تسلسل amplicons PCR. ظهور الجيل التالي من التسلسل وتبسيط بشكل كبير وزيادة عمق التسلسل ل16S الرنا الريباسي تسلسل الجين. إدخال التعاقب الفوق يسمح الآن مختبرات صغيرة لأداء لهم 16S الرنا الريباسي التسلسل في المنزل في غضون أيام. هنا، هو مفصل نهجا ل16S الرنا الريباسي amplicon الجين تسلسل باستخدام الفوق الجيل القادم من المنظم. يتم تضخيم الحمض النووي البيئي أولا بواسطة PCR باستخدام بادئات التي تحتوي على محولات التسلسل والباركود. ثم تقترن لهم جسيمات كروية عبر مستحلب PCR. الجسيمات هي ليترoaded على رقاقة يمكن التخلص منها ويتم إدخال الشريحة في الجهاز التسلسل وبعد ذلك يتم إجراء التسلسل. يتم استردادها في شكل تسلسل fastq وتصفيتها ويتم استخدام الباركود لإنشاء عضوية عينة من يقرأ. وتصفيتها واهمال يقرأ ثم يتم تحليلها باستخدام الأدوات المتاحة علانية. تحليل المثال حيث يقرأ صنفت مع خوارزمية تقصي التصنيف ضمن حزمة البرامج وتعطى Mothur. الطريقة الموضحة هنا هو بسيطة وغير مكلفة واضحة وينبغي أن تساعد مختبرات صغيرة للاستفادة من الثورة الجينومية الجارية.
Introduction
التسلسل ميتاجينومية هي تقنية قوية جدا لأنها تستهدف مجمل المعلومات الوراثية الموجودة في عينة بيئية. هناك نكهات مختلفة من التسلسل ميتاجينومية، بما في ذلك التسلسل بندقية والمكتبات واسع إدراج وamplicon التسلسل. Amplicon تسلسل يوفر ميزة كونها غير مكلفة نسبيا وسريعة وقادرة على انتاج يقرأ من منطقة الجينومية واحدة يمكن الانحياز عموما. بالإضافة إلى ذلك، سير العمل لتحليل البيانات amplicon التسلسل وموحدة في الغالب. ولكن بما أنه يقوم على PCR، فإنه لديه كل التحيزات المتعلقة بخصوصية كاملة، تغطية ناقصة ويتحيز التمهيدي 1،2، مما يجعل هذا النهج شبه الكمي في أحسن الأحوال. العديد من المناطق الجينومية يمكن استهداف للالتسلسل amplicon بما في ذلك الجينات الوظيفية، ولكن الخيارات الأكثر شعبية هي استخدام الجينات علامة مثل الجينات 16S الرنا الريباسي لإنشاء ملف تعريف المجتمع. تقليديا، الجينات 16S الرنا الريباسي amplicon sequeوقد أجريت ncing خارج باستخدام تقنيات كثيفة العمالة التي شملت الاستنساخ في E. القولونية، قطف مستعمرة واستخراج بلازميد تليها سانجر تسلسل على البلازميدات معزولة، وبالتالي تحليلها معظم الدراسات أقل من 100 استنساخ لكل عينة. جلبت الجيل المقبل من التسلسل اثنين التقدم رئيسية: الموازاة الهائل من ردود الفعل التسلسل، والأهم من ذلك، فصل النسيلي من القوالب دون الحاجة لادخال شظايا الجينات في مضيف. وهذا تبسيط كبير تسلسل الجينات 16S الرنا الريباسي amplicons، الذي هو الآن يعود إلى ميزة الروتينية العديد من الدراسات علم الأحياء الدقيقة البيئي، مما أدى إلى "النهضة" ل16S الرنا الريباسي تسلسل الجين amplicon 3.
منذ ظهور روش 454 تسلسل 4 في عام 2005، ظهرت عدة تقنيات الجيل القادم التسلسل الأخرى في السوق (على سبيل المثال، البورشيد، الصلبة، PacBio). في الآونة الأخيرة، وإدخال تسلسل مقعد بين كبارجلبت التمرير إلى مختبرات صغيرة القدرة التسلسل حكرا على مراكز التسلسل كبيرة. هي خمس آلات الفوق المتاحة حاليا: 454 GS جديد، وايون سيل آلة الجينوم الشخصية (PGM)، وبروتون، والبورشيد MiSeq وNextSeq 500. حين أن جميع هذه التعاقب تقدم أقل يقرأ في تشغيل وقواعد أقل لكل دولار من معظم بالدوام الكامل التعاقب النطاق، فهي أكثر مرونة، وسرعة، وانخفاض اقتناء وتشغيل تكاليفها يجعلها في متناول المختبرات الأكاديمية الصغيرة. بشكل خاص مناسبة التعاقب الفوق جيدا لamplicon، الجينوم صغيرة ومنخفضة التعقيد metagenome التسلسل في دراسات علم الأحياء الدقيقة البيئية، لأن هذا النوع من الدراسات عموما لا يحتاج إلى عمق المدقع من التسلسل. على سبيل المثال، فإنه من المتفق عليه عموما أن لل16S الرنا الريباسي تسلسل الجين يدرس عدد من يقرأ لكل عينة ليست قصوى، و~ 1،000 يقرأ يمكن أن تولد نفس أنماط وعدة ملايين من يقرأ مجموعات البيانات 5. أما وقد قلت ذلك، الفوق المقبل generatio ن التعاقب تزال تولد كميات كبيرة من البيانات تسلسل، مع عائدات القصوى ل~ 35 م ب ب (454 GS جديد)، ~ 2 جنيها استرلينيا (ايون السيل PGM)، ~ 10-15 جنيها استرلينيا (ايون سيل بروتون)، ~ 10 جنيها استرلينيا (البورشيد MiSeq) و~ 100 جنيها استرلينيا (البورشيد التالي تسلسل 500)، والتي هي أكثر من كافية لمعظم دراسات علم الأحياء الدقيقة البيئية.
الجيل المقبل من تسلسل amplicons 16S الرنا الريباسي باستخدام التعاقب الفوق تم تطبيقها مؤخرا إلى مجموعة واسعة من البيئات. على سبيل المثال، تم استخدام ايون السيل PGM المجتمع لتحليل مخلفات منجم اليورانيوم الذي كان درجة الحموضة العالية والمنخفضة خاصة نفاذية 6، من إعادة تدوير نظم الاستزراع 7 من التربة الملوثة النفط والغاز في القطب الشمالي 8،9، التعدين رواسب الرمال النفطية المتضررة و الأغشية الحيوية من نهر أثاباسكا 10،11 من الجذور لالصفصاف المزروعة في التربة الملوثة 12، الهيئات الإنسان والحيوان و13-16 من الهضم اللاهوائي 17.
jove_content "> وفي هذه المساهمة التفاصيل نحن نهجنا في تسلسل الجينات 16S الرنا الريباسي amplicons في المنزل باستخدام الفوق الجيل القادم من المنظم (لايون السيل PGM)، وبعد استخراج الحمض النووي والجينات 16S الرنا الريباسي وتتضخم باستخدام بادئات البكتيرية مستوى المجال التي تحتوي على محولات التسلسل وفريدة من نوعها، متواليات عينة محددة (الباركود)، ويتم تنقية amplicons، كميا والمجمعة في نسبة متساوي المولية. ثم يتم تضخيم هذه العينات المجمعة clonally في مستحلب PCR والتسلسل. ويتم تحليل تسلسل الناتجة باستخدام أدوات المعلوماتية الحيوية المتاحة للجمهور ( على سبيل المثال، Mothur).Protocol
Representative Results
Discussion
الطريقة المعروضة هنا واضح وصريح وغير مكلفة، ويجب أن تسمح العديد من المختبرات للوصول إلى السلطة من التسلسل ميتاجينومية. على الرغم من أنه يختلف تبعا لمنصة تسلسل المستخدمة، مرة واحدة هي التي شيدت المكتبات مطلوب القليل جدا من التدريب العملي في الوقت المحدد، مع أكثر من عملية يجري المؤتمتة. لمنصة تسلسل المستخدمة هنا (ايون السيل PGM)، يمكن تنفيذ الإجراء الكامل في غضون يومين من العمل. في لحظة الكتابة (سبتمبر) 2013، كانت تكاليف كاشف المتعلقة المثال المفصلة أعلاه كما يلي: PCR التضخيم من 36 عينة: 25 دولارا، تنقية جل وPicoGreen DNA الكميات من 36 عينة: $ 125، مستحلب PCR لعينة واحدة amplicon المجمعة : 150 دولار والكواشف التسلسل: 250 دولار، أي ما مجموعه 550 دولار أو 15 دولارا للعينة أو 0،0015 $ لكل تصفيتها جودة القراءة. هذا السعر لا يشمل العقد أداة الخدمة، وانخفاض قيمة الصك، راتب فني واستخدام مساحة المختبر.
خيمة "> واحدة من الخطوات الأكثر أهمية هو أن تجمع جميع المنتجات في نسبة متساوي المولية، من أجل استرداد عدد مماثل من يقرأ لكل من العينات. تم استخدام PicoGreen الكمي هنا، ولكن أساليب أخرى قد تكون مناسبة، وإن كان أقل دقة (على سبيل المثال، القياس الكمي للأشعة فوق البنفسجية، الكمي القائم على هلام)، وحتى عن طريق القيام بما الكمي الأكثر دقة وتجميع، هناك بعض التباين في عدد من يقرأ لكل عينة، وعلى المدى نموذجي مفصل في الجدول 2، ويتراوح من 4،380 إلى 32،750 يقرأ، بمتوسط 10،338 يقرأ، وإذا معالجة عدد كبير من العينات (أكثر من 40-50)، عمود واحد تنقية هلام يمكن الاستعاضة عن تنقية هلام في لوحة أو تنقية باستخدام الخرز مع قطع حجم صرامة (مثل حبات AMPure) .حتى الآن، الجيل المقبل من تكنولوجيا التسلسل الأكثر استخداما لهذا الجين 16S الرنا الريباسي هي 454. وايون سيل تكنولوجيا التسلسل المستخدمة في هذا البروتوكول هو المفهوم مشابهة جداإلى 454 وكلا التقنيتين عرضة لنفس النوع من الأخطاء التسلسل. ليس من المستغرب، أنه قد تبين أنه ايون سيل التسلسل أسفرت نتائج التسلسل مشابهة جدا ل454 تسلسل 10. في الآونة الأخيرة، واستكشفت العديد من الباحثين استخدام التكنولوجيا البورشيد لل16S الرنا الريباسي تسلسل الجين amplicon 18،19. في أي حال، سيكون من السهل على التكيف مع البروتوكول الحالي للالتعاقب الفوق أخرى مثل MiSeq البورشيد أو 454 GS جديد عن طريق تغيير تسلسل الانصهار التمهيدي لتتناسب مع المحولات والباركود اللازمة لهذه التقنيات التسلسل، كما في طريقة وصفها مؤخرا لالبورشيد MiSeq 19. بدلا من ذلك، يمكن للباحثين تتبع الخطوات 1 و 2 من بروتوكول مفصلة هنا وإرسال amplicons المجمعة إلى مركز التسلسل حيث سيتم تنفيذ مستحلب PCR وتسلسلها.
الجينات 16S الرنا الريباسي يقرأ وقلص وتصنيفها باستخدام Mothur، ولكن العديد من التحليلات الأخرى لا يمكن أن يؤديها علىamplicons الجين 16S الرنا الريباسي. على سبيل المثال، والتنوع بيتا يمكن تقييمها عن طريق حساب المسافات بين كل زوج Unifrac عينة باستخدام الإجراء المذكورة في http://unifrac.colorado.edu/ 20. ويمكن حساب مؤشرات التنوع ألفا وعدد الوحدات التصنيفية التشغيلية من كل عينة باستخدام أدوات داخل QIIME مثل AmpliconNoise 21 أو باستخدام الإجراء حددها HUSE آخرون 22 والمتاحة داخل Mothur.
الاشعال المستخدمة هنا ضخمت مناطق متغيرة 3 و 4 من الجينات 16S الرنا الريباسي، ولكن يمكن أن استهدفت العديد من المناطق الأخرى. في الدراسة الحالية، تم تضخيم الجينات 16S الرنا الريباسي من المواد النباتية وجاء اختيار التمهيدي لتجنب التضخيم من بلاستيدات الخضراء 16S الرنا الريباسي الجينات 23،24. هناك طائفة واسعة من الاشعال الأخرى المتاحة التي تختلف من حيث طول المنتج، والطاقة التصنيفية وفائدة 25،26. ولكن في جميع الحالات 200-400 BP يقرأ من الجينات 16S الرنا الريباسي لا يمكن تصنيفها بشكل موثوق على مستوى الأنواع، والتحليلات تقتصر على جنس والمستويات التصنيفية أعلى. جينات أخرى قد تكون أكثر ملاءمة إذا كانت هناك حاجة المعلومات على مستوى الأنواع، مثل cpn60 وrpoB الجينات 27،28. قطرات جذرية في المستقبل في تكلفة تسلسل وزيادة قوة الأدوات التحليلية قد تجعل من المجدي استبدال 16S الرنا الريباسي تسلسل الجين بواسطة metagenomics بندقية، ولكن حتى ذلك الحين يبقى 16S الرنا الريباسي تسلسل الجين المعيار الذهبي علم الأحياء الدقيقة البيئي.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Development of the method presented here has been carried out with various sources of funding, including Genome Canada and Genome Quebec, Environment Canada STAGE program and internal NRC funds.
Materials
| Reagent | Company | Catalog Number |
| Ion 314 Chip Kit v2 | Life Technologies | 4482261 |
| Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 | Life Technologies | 4482006 |
| Ion PGM Template OT2 200 Kit | Life Technologies | 4480974 |
| HotStarTaq Plus Master Mix Kit | Qiagen | 203646 |
| Primers and probes | IDT | NA |
| Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 |
| BSA 20 mg/ml | Roche | 10,711,454,001 |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies | 65001 |
References
- Sipos, R., et al. Addressing PCR biases in environmental microbiology studies. Methods Mol. Biol. 599, 37-58 (2010).
- Schloss, P. D., et al. Reducing the effects of PCR amplification and sequencing artifacts on 16S rRNA-based studies. PLoS ONE. 6, e27310 (2011).
- Tringe, S. G., Hugenholtz, P. A renaissance for the pioneering 16S rRNA gene. Curr. Opin. Microbiol. 11, 442-446 (2008).
- Margulies, M., et al. Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature. 437, 376-380 (2005).
- Kuczynski, J., et al. Microbial community resemblance methods differ in their ability to detect biologically relevant patterns. Nat. Methods. 7, 813-819 (2010).
- Bondici, V. F., et al. Microbial communities in low-permeability, high pH uranium mine tailings: characterization and potential effects. J. Appl. Microbiol. 113, 1671-1686 (2013).
- Auffret, M., et al. Impact of water quality on the bacterial populations and off-flavours in recirculating aquaculture systems. FEMS Microbiology Ecology. 84, 235-247 (2013).
- Bell, T. H., Yergeau, E., Juck, D., Whyte, L. G., Greer, C. W. Alteration of microbial community structure affects diesel biodegradation in an Arctic soil. FEMS Microbiol. Ecol. 85, 51-61 (2013).
- Bell, T. H., et al. Predictable bacterial composition and hydrocarbon degradation in Arctic soils following diesel and nutrient disturbance. ISME J. 7, 1200-1210 (2013).
- Yergeau, E., et al. Next-generation sequencing of microbial communities in the Athabasca River and its tributaries in relation to oil sands mining activities. Appl. Environ. Microbiol. 78, 7626-7637 (2012).
- Yergeau, E., et al. Aerobic biofilms grown from Athabasca watershed sediments are inhibited by increasing bituminous compounds concentrations. Appl. Environ. Microbiol. 79, 7398-7412 (2013).
- Yergeau, E., et al. Microbial expression profiles in the rhizosphere of willows depend on soil contamination. ISME J. 8, 344-358 (2013).
- Deagle, B. E., et al. Quantifying sequence proportions in a DNA-based diet study using Ion Torrent amplicon sequencing: which counts count. Mol. Ecol. Resour. 13, 620-633 (2013).
- Milani, C., et al. Assessing the fecal microbiota: an optimized Ion Torrent 16S rRNA gene-based analysis protocol. PLoS ONE. 8, e68739 (2013).
- Jünemann, S., Prior, P., Szczepanowski, R., Harks, I., Ehmke, B., Goesmann, A., Stoye, J., Dag Harmsen, . Bacterial community shift in treated periodontitis patients revealed by Ion Torrent 16S rRNA gene amplicon sequencing. PLoS ONE. 7, e41606 (2012).
- Petrof, E., et al. Stool substitute transplant therapy for the eradication of Clostridium difficile infection: ‘RePOOPulating’ the gut. Microbiome. 1, 3 (2013).
- Whiteley, A. S., et al. Microbial 16S rRNA Ion Tag and community metagenome sequencing using the Ion Torrent (PGM) Platform. J. Microbiol. Meth. 91, 80-88 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6, 1621-1624 (2012).
- Kozich, J. J., et al. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing platform. Appl. Environ. Microbiol. 79, 5112-5120 (2013).
- Hamady, M., et al. Fast UniFrac: facilitating high-throughput phylogenetic analyses of microbial communities including analysis of pyrosequencing and PhyloChip data. ISME J. 4, 17-27 (2010).
- Quince, C., et al. Removing noise from pyrosequenced amplicons. BMC Bioinformatics. 12, 38 (2011).
- Huse, S. M., et al. Ironing out the wrinkles in the rare biosphere through improved OTU clustering. Environ. Microbiol. 12, 1889-1898 (2010).
- Edwards, J. E., et al. Characterization of the dynamics of initial bacterial colonization of nonconserved forage in the bovine rumen. FEMS Microbiol. Ecol. 62, 323-335 (2007).
- Rastogi, G., et al. A PCR-based toolbox for the culture-independent quantification of total bacterial abundances in plant environments. J. Microbiol. Methods. 83, 127-132 (2010).
- Baker, G. C., et al. Review and re-analysis of domain-specific 16S primers. J. Microbiol. Methods. 55, 541-555 (2003).
- Schloss, P. D. The effects of alignment quality, distance calculation method, sequence filtering, and region on the analysis of 16S rRNA gene-based studies. PLoS Comput. Biol. 6, e1000844 (2010).
- Links, M. G., et al. The chaperonin-60 universal target Is a barcode for bacteria that enables de novo assembly of metagenomic sequence data. PLoS ONE. 7, e49755 (2012).
- Vos, M., et al. Comparison of rpoB and 16S rRNA as markers in pyrosequencing studies of bacterial diversity. PLoS ONE. 7, e30600 (2012).
