بروتوكول لتصيب<em> انواع معينة ايليجانس</em> مع<em> السالمونيلا التيفية الفأرية</em
Summary
وقد برزت C. ايليجانس نموذجا وراثية جديدة لدراسة التفاعلات المضيف الممرض. نحن هنا وصف بروتوكول لتصيب C. ايليجانس مع السالمونيلا التيفية الفأرية إلى جانب تقنية التدخل رني المزدوج حبلا لدراسة دور الجينات المضيف في الدفاع ضد العدوى السالمونيلا.
Abstract
في العقد الماضي، C. برز ايليجانس كما كائن حي اللافقارية لدراسة التفاعلات بين المضيفين ومسببات الأمراض، بما في ذلك الدفاع المضيف ضد البكتيريا سالبة الجرام السالمونيلا التيفية الفأرية السالمونيلا يحدد العدوى المستمرة في الأمعاء من C. ايليجانس والنتائج في الموت المبكر من الحيوانات المصابة. وقد تم تحديد عدد من الآليات الحصانة في C. ايليجانس للدفاع ضد العدوى السالمونيلا. الالتهام الذاتي، والحفاظ تطويريا تدهور الليزوزومية المسار، وقد تبين للحد من تكرار السالمونيلا في C. وايليجانس في الثدييات. هنا، يوصف بروتوكول لتصيب C. ايليجانس مع السالمونيلا التيفية الفأرية، الذي يتعرض لالسالمونيلا الديدان لفترة زمنية محدودة، على غرار عدوى السالمونيلا في البشر. يقصر عدوى السالمونيلا بشكل كبير من عمر C. ايليجانس <م />. الالتهام الذاتي باستخدام الجينات الأساسية تيرو-1 كمثال على ذلك، ونحن معا هذه الطريقة الإصابة بفيروس C. ايليجانس رني تغذية النهج وأظهر هذا البروتوكول يمكن استخدامها لدراسة وظيفة C. ايليجانس الجينات المضيف في الدفاع ضد العدوى السالمونيلا. منذ C. ايليجانس الجينوم هي المكتبات رني كله المتاحة، هذا البروتوكول يجعل من الممكن لفحص شامل لC. الجينات ايليجانس التي تحمي ضد السالمونيلا ومسببات الأمراض المعوية الأخرى باستخدام المكتبات رني على نطاق الجينوم.
Introduction
الديدان الخيطية التربة الحرة الحية انواع معينة ايليجانس هو كائن نموذج بسيط ولين العريكة وراثيا تستخدم لدراسة العديد من الأسئلة البيولوجية. C. ايليجانس موجود يغلب كما المنحرفين-التسميد الذاتي. يتم إنشاؤها من قبل الذكور بشكل عفوي غير انفصال للكروموسوم X أثناء عملية تكوين الأمشاج 1،2. في ظل وجود وفرة من المواد الغذائية، C. ايليجانس تطوير مستمر من خلال أربع مراحل اليرقات إلى الكبار. درجة الحرارة يؤثر أيضا C. التنمية ايليجانس؛ لوحظ تطور أسرع عند ارتفاع درجات الحرارة. في المختبر، C. ايليجانس هو مثقف في درجة حرارة قياسية من 20 درجة مئوية على لوحات أجار مع المصنف القولونية بكتيريا الإشريكية (سلالة OP50) كغذاء 1،2.
في العقد الماضي، C. برز ايليجانس كما كائن حي اللافقارية لدراسة التفاعلات المضيف الممرض 3-5. في الطبيعة، C. ايليجانس يأكل البكتيريا كما nutrien لهار المصدر 1،2. العادية الطعام المختبر الجرثومي، OP50، يمكن أن تكون بديلا بسهولة مع مسببات الأمراض الأخرى لدراسة التفاعلات بين C. ايليجانس وأي الممرض الذي تم اختياره. في ظل هذه الظروف، الأمعاء هو الموقع الرئيسي للعدوى. في الواقع، وقد تبين مجموعة واسعة من مسببات الأمراض البكتيرية للإصابة قاتلة C. ايليجانس 3-5.
بكتيريا السالمونيلا سالبة الجرام هو الممرض الجهاز الهضمي التي تسبب الأمراض التي تنقلها الأغذية الإنسان في العالم 6،7. C. ايليجانس هو المضيف نموذجا جيدا للالسالمونيلا التيفية الفأرية كما يعيد هذه البكتيريا والالتهابات المعوية يسلك المستمرة 8-10. C. وقد استخدم ايليجانس لتحديد كل من الرواية والعوامل المعروفة سابقا الفوعة السالمونيلا 11. ومن المثير للاهتمام، وC. الجهاز المناعي ايليجانس يحد بنجاح تكرار السالمونيلا. وقد أفيد في وقت سابق ان inhibition الجينات الالتهام الذاتي يجعل زيادة تكرار السالمونيلا في C. ايليجانس، مما أدى إلى وفاة مبكرة من الديدان المصابة 10. Macroautophagy (المشار إليها هنا الالتهام الذاتي) هو عملية دينامية تنطوي على إعادة ترتيب الأغشية التحت خلوية لعزل السيتوبلازم والعضيات للتسليم إلى يحلول لتدهور 12. وقد تم الإبلاغ عن الالتهام الذاتي للحد من تكرار السالمونيلا في C. ايليجانس و10،13 في الثدييات.
وC. كان ايليجانس الجينوم أول جينوم حقيقية النواة متعددة الخلايا متسلسلة؛ هو استجابة للعلاج رني 14-16. علاوة على ذلك، رني يمكن إدارتها بفعالية بإخضاع الديدان لاستيعاب البكتيريا التي تحتوي على الحمض النووي الريبي مزدوج الخيط من الجين المستهدف، والمعروفة باسم رني تغذية 16،17. تم إنشاؤها الجينوم المكتبات التغذية رني كامل لالجينوم على نطاق رني الفرز 16،18. هنا، والسالمونيلا العدوى المواليةويقترن tocol مع رني تغذية للسماح اختبار C. الجينات ايليجانس الاهتمام لقدرتها على حماية ضد عدوى السالمونيلا.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. ايليجانس هو كائن نموذج الوراثية بسيط هو أن يأكل البكتيريا كمصدر المغذيات فيها. وبالتالي، فمن السهل أن تحل محل المواد الغذائية البكتيرية العادية مع الممرض الأمعاء للتحقيق في التفاعلات بين C. ايليجانس والممرض الذي تم اختياره. هنا يوصف بروتوكول لعدوى السا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتورة ديان Baronas-ويل لقراءة نقدية للمخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل وحدة التحليل المالي تشارلز إي شميت كلية العلوم غرانت البذور ومنحة الشيخوخة من مؤسسة إليسون الطبية لKJ
Materials
| LB Broth | Fisher | BP9723-500 | |
| XLD agar | EMD Chemicals | 1.05287.0500 | |
| Bacto Agar | Fisher | DF0140-01-0 | |
| Peptone | Fisher | BP1420-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | S671-500 | |
| Calcium Chloride | Fisher | C69-500 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M65-500 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | 12481C50 | |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | |
| Ampicillin | Fisher | BP1760-25 | |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | |
| Petri Dish 95 x 15mm | Fisher | FB0875714G | |
| Petri Dish 60 x 15mm | Fisher | 08-757-13A | |
| Falcon Serological pipet | Fisher | 13-668-2 | |
| Falcon Express Pipet-Aid | Fisher | 13-675-42 | |
| MaxQ6000 shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE6000-7 | |
| Incubator | Percival | I-36DL |
References
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. . C. elegans II. , (1997).
- Brenner, S. The Genetics of Caenorhabditis elegans. 遗传学. 77, 71-94 (1974).
- Aballay, A., Ausubel, F. M. Caenorhabditis elegans as a host for the study of host-pathogen interactions. Curr Opin Microbiol. 5, 97-101 (2002).
- Kurz, C. L., Ewbank, J. J. Caenorhabditis elegans: an emerging genetic model for the study of innate immunity. Nat Rev Genet. 4, 380-390 (2003).
- Mylonakis, E., Aballay, A. Worms and flies as genetically tractable animal models to study host-pathogen interactions. Infection and Immunity. 73, 3833-3841 (2005).
- Ford, M. W., et al. A descriptive study of human Salmonella serotype typhimurium infections reported in Ontario from 1990 to 1997. Can J Infect Dis. 14, 267-273 (2003).
- Voetsch, A. C., et al. FoodNet estimate of the burden of illness caused by nontyphoidal Salmonella infections in the United States. Clin Infect Dis. 38 Suppl 3, (2004).
- Aballay, A., Yorgey, P., Ausubel, F. M. Salmonella typhimurium proliferates and establishes a persistent infection in the intestine of Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 10, 1539-1542 (2000).
- Alegado, R. A., Tan, M. W. Resistance to antimicrobial peptides contributes to persistence of Salmonella typhimurium in the C. elegans intestine. Cell Microbiol. 10, 1259-1273 (2008).
- Jia, K., et al. Autophagy genes protect against Salmonella typhimurium infection and mediate insulin signaling-regulated pathogen resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 14564-14569 (2009).
- Tenor, J. L., McCormick, B. A., Ausubel, F. M., Aballay, A. Caenorhabditis elegans-based screen identifies Salmonella virulence factors required for conserved host-pathogen interactions. Curr Biol. 14, 1018-1024 (2004).
- Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).
- Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole. J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).
- . The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2, 1-10 (2001).
- Liang, J., Xiong, S., Savage-Dunn, C. Using RNA-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode C elegans. J. Vis. Exp. (72), (2013).
- Fraser, A. G., et al. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the online review of C elegans biology. , 1-11 (2006).
- Aballay, A., Ausubel, F. M. Programmed cell death mediated by ced-3 and ced-4 protects Caenorhabditis elegans from Salmonella typhimurium-mediated killing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 2735-2739 (2001).
- Melendez, A., et al. Autophagy genes are essential for dauer development and lifespan extension in C. elegans. Science. 301, 1387-1391 (2003).
