Valutazione del cancro ovarico Spheroid attaccamento e l'invasione delle cellule mesoteliali in tempo reale
Summary
Ovarico invasione delle cellule di cancro nel rivestimento mesoteliali del peritoneo è un processo dinamico nel tempo. Utilizzando un analizzatore in tempo reale, la capacità invasiva delle cellule tumorali ovariche in una cella modello di co-coltura sferoide-mesoteliali può essere quantificato in periodi di tempo prolungati, fornendo approfondimenti fattori che regolano il processo metastatico.
Abstract
Tumori ovarici metastasi versando nel liquido peritoneale e disperdendo ai siti distali all'interno del peritoneo. Colture monostrato non modellare accuratamente i comportamenti delle cellule tumorali in un ambiente non aderente, come le cellule tumorali intrinsecamente aggregano in strutture multicellulari che contribuiscono al processo metastatico legandosi e invadendo il rivestimento peritoneale di formare tumori secondari. Per modellare questa importante fase di metastasi del cancro ovarico, aggregati multicellulari, o sferoidi, possono essere generati da linee cellulari di carcinoma ovarico istituiti conservato in condizioni non aderenti. Per simulare il microambiente peritoneale incontrato dalle cellule tumorali in vivo, un modello di co-coltura sferoide-mesoteliali stato stabilito in cui preformate sferoidi sono placcati su di un monostrato di cellule mesoteliali umano, formata su una barriera matrice extracellulare. Metodi sono stati poi sviluppati utilizzando un analizzatore di cella in tempo reale per condurre reale quantitativamisure di tempo della capacità invasiva delle differenti linee di cellule di cancro ovarico coltivate come sferoidi. Questo approccio consente la misura continua di invasione per lunghi periodi di tempo, che ha diversi vantaggi rispetto saggi endpoint tradizionali e analizza immagine microscopia tempo reale più laborioso. In breve, questo metodo permette una rapida determinazione dei fattori che regolano le interazioni tra cellule ovariche sferoidali cancro invasione attraverso mesoteliali e matrice ostacoli nel tempo.
Introduction
Il cancro ovarico ha il più alto tasso di mortalità di tutti i tumori ginecologici 1. In tutto il mondo, ci sono ~ 230.000 casi e 100.000 decessi dovuti alla malattia ogni anno 1. La maggior parte dei pazienti (> 75%) sono diagnosticati dopo che il cancro si è già metastatizzato, quando il trattamento è ulteriormente complicata da una maggiore resistenza alla chemioterapia e la prognosi è infausta 2. I pazienti con stadio III-IV malattia metastatica hanno 5 anni i tassi di sopravvivenza di solo il 30-40% 3. Pertanto, vi è una necessità urgente di una migliore comprensione dei comportamenti cellulari alla base metastasi del cancro ovarico per trattare efficacemente la malattia avanzata.
L'attuale modello di metastasi del cancro ovarico propone diverse fasi nel processo metastatico, ciascuno dei quali si verifica in un microambiente distinto che incide sul comportamento del tumore. Metastatico delle cellule tumorali ovariche inizialmente cadono dal sito del tumore primario e sopravvivere in un nonadherstato ent nel fluido peritoneale come singole cellule o strutture multicellulari tridimensionali, definito aggregati multicellulari o sferoidi 2,4,5. Le cellule che non fanno sferoidi in sospensione sono più suscettibili a anoikis 2,4,5. Sferoidi esibiscono anche una maggiore resistenza a chemioterapici, contribuendo alla malattia residua e successiva ricorrenza del cancro 2,4,5. Un secondo passo fondamentale nella metastasi del cancro ovarico è il passaggio di aggregati da cluster free-floating ai tumori secondari stabiliti all'interno della parete peritoneale e omento 5,6. Interazioni cellula-cellula e cellula-substrato sono stati implicati nella formazione di aggregati, la sopravvivenza e l'adesione alla matrice extracellulare (ECM) prodotta dal rivestimento mesoteliali del peritoneo 4-11. Al momento, questi processi sono poco conosciuti.
Per definire i meccanismi coinvolti nella diffusione dei tumori ovarici, sferoidi possono essere generATED da linee cellulari di cancro stabiliti con metodi di coltura non aderenti, mantenendo le cellule in sospensione o aggiungendo metilcellulosa ai terreni di coltura 12,13 o coltivando cellule su piastre basso attaccamento 2,14. Quando coltivate in questo modo, le cellule tumorali ovariche assemblano in aggregati multicellulari o sferoidi che presentano analoghe proprietà cellulari, molecolari e biochimici a quelli degli aggregati tumorali presenti in vivo 2,14. Dopo la formazione, sferoidi possono essere successivamente raccolti dal mezzo nonadherent e ripiastrate su una varietà di superfici solide per ulteriori studi funzionali. Questo rappresenta un progresso rispetto saggi in coltura monostrato, che non modellare accuratamente i comportamenti di cellule tumorali ovariche metastatizzanti all'interno di un ambiente nonadherent come fluido intraperitoneale.
La capacità invasiva delle sferoidi tumorali può essere valutata in saggi endpoint tradizionali Boyden camere 2 </sup>, ma questo approccio può essere fuorviante, come l'invasione delle cellule di cancro ovarico è un processo dinamico nel tempo. Un metodo real-time recente è stato ideato utilizzando time-lapse video microscopia della clearance cellule mesoteliali invadendo sferoidi tumorali ovariche 15,16; Tuttavia, l'analisi di dati time lapse richiede tempo e può essere personale. Qui, una rapida, metodo quantitativo per valutare i comportamenti invasivi di sferoidi tumorali ovariche in tempo reale è descritto. In primo luogo, un modello cellulare sferoide-mesoteliali è stato stabilito che rappresenta la fase di metastasi del cancro ovarico quando sferoidi multicellulari attaccarsi e invadere il rivestimento peritoneale a formare tumori secondari. Poi metodologia per un analizzatore in tempo reale cellulare (RTCA, vedere la tabella Materiali per i dettagli dell'azienda) è stato adattato per condurre quantitativi reali misure di tempo della capacità invasiva delle differenti linee di cellule di cancro ovarico coltivate come sferoidi e testati in questo modello.
Nel RTCA instrumento, risposte cellulari vengono monitorati in continuo nel corso di un saggio, senza la necessità di etichette esogeni, da variazioni di impedenza elettrica di misura. Piastre di coltura appositamente progettati hanno microelettrodi oro rivestite situati sotto una membrana microporosa all'interfaccia tra le camere superiori e inferiori di un 2 concamerate bene (piastre «CIM»). La posizione degli elettrodi nella camera inferiore consente la misurazione delle variazioni di impedenza elettrica come cellule invadono attraverso un ECM o ECM / barriera cellulare. L'interfaccia membrana tra le 2 camere di ciascuna piastra CIM bene viene dapprima rivestito con il componente ECM di interesse. Nel sistema modello cellulare sferoide-mesoteliali, l'interfaccia è rivestita con uno strato di Matrigel (vedere la tabella Materiali per i dati aziendali), per imitare il complesso ECM sottostante il rivestimento mesoteliali del peritoneo, seguito da un monostrato confluente di mesoteliali umano ' "cellule bersaglio. Infine, preformati sferoidi tumorali ovariche sono annuncided. Cellule sferoidali cancro ovarico devono invadere attivamente attraverso lo strato di cellule bersaglio e la matrice per raggiungere la camera inferiore e alterare le letture di impedenza elettrica. Cellule bersaglio in proprio sono valutati anche per garantire che essi non invadono attraverso lo strato di matrice e sono adatti per l'uso in questo saggio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Invadere le cellule tumorali ovariche interagire con una varietà di tipi di cellule sulla superficie del peritoneo, comprese fibroblasti, adipociti e cellule mesoteliali, e la comunicazione bidirezionale tra cellule tumorali e cellule peritoneali è pensato di svolgere un ruolo chiave nel guidare il processo metastatico 2. Una volta masterizzato, il protocollo qui descritto è facilmente adattabile allo studio di queste interazioni nel microambiente peritoneale, ad esempio, mediante l'aggiunta di citochine esogene, fattori di crescita, o inibitori specifici verso le camere superiori o inferiori della piastra CIM bene o manipolazione genetica del cancro o linee cellulari peritoneale. Inoltre, questo metodo può essere usato con cellule di tumore ovarico primari raccolti di fresco da asciti maligne e / o cellule peritoneali primari per avere una visione diretta nelle segnali regolatori e le interazioni cellulari che regolano la creazione di una lesione metastatica all'interno della cavità peritoneale <sup> 2.
L'uso dello strumento RTCA per misurare la capacità invasiva delle cellule singole o sferoidi offre diversi vantaggi rispetto ai tradizionali saggi endpoint singoli e analisi di immagini time-lapse. Lo strumento RTCA misura invasione cellulare a intervalli definiti in continuo nel corso di un saggio, che può essere ore o giorni. Ciò consente la determinazione delle variazioni del tasso di invasione nel tempo, che supera i limiti dei dosaggi singoli endpoint. Ad esempio, esaminando i dati invasione delle diverse linee cellulari di cancro in un singolo endpoint (Figura 2), ad esempio, 3 ore, potrebbe aver portato alla conclusione erronea che KGN e OVCA433 cellule erano molto più invasivo rispetto OVCA429 cellule. Un altro vantaggio di questa tecnologia è che lo strumento RTCA misura variazioni di impedenza elettrica. Ciò significa che le analisi possono essere eseguiti senza etichettare le cellule con un agente esogeno, che potrebbe avere effetti indesiderati su phen cellulareotype o funzione. Questo diventa particolarmente importante quando si studiano le cellule tumorali ovariche primarie derivate da asciti maligne, con cui è essenziale mantenere manipolazioni al minimo in modo da evitare di introdurre cambiamenti molecolari e fenotipici che non riflettano la loro natura in vivo 2. Inoltre, l'uso dello strumento RTCA consente la raccolta di dati quantitativi in tempo reale, che non solo evita la perdita di tempo analisi associati microscopia time-lapse ma anche consente la rapida determinazione della chiave finestre sperimentali per l'ottimizzazione del saggio. Ciò è particolarmente utile quando si confrontano gli effetti di una serie di fattori di invasione sferoide, fattori come diversi possono esercitare i loro effetti massimi a diversi intervalli di tempo o con differenti profili notevolmente nel tempo.
Anche se questo protocollo è suscettibile di modifiche (ad esempio, l'uso di matrici diverse ECM, diverse linee di cellule di cancro, o target diverso cells), se ciò, è importante notare che diverse condizioni sperimentali devono prima essere ottimizzati. Ad esempio, prima di iniziare studi di invasione sferoide, il numero ottimale di cellule tumorali / piastra CIM bene dovrebbe innanzitutto essere determinata mediante saggio del numero di cellule titolazioni in coltura monostrato. Il numero ottimale di sferoidi da utilizzare per ben si basa quindi su questa analisi. Ad esempio, nel metodo corrente, sferoidi comprendono circa 3.000 cellule ogni momento della generazione. Se iniziali numero di cellulare titolazioni indicano che 30.000 cellule in monostrato sono ottimali per il rilevamento nell'invasione analisi, poi 10 sferoidi sono aggiunti per piastra CIM bene. Inoltre, per lo svolgimento di esperimenti di co-coltura, è importante studiare i comportamenti del 'bersaglio' monostrato cellulare separatamente al fine di determinare se queste cellule sono intrinsecamente invasiva, in quanto ciò potrebbe confondere i risultati. Nell'esempio mostrato, sferoidi tumorali sono placcati su di un Monola cella LP9yer, con e senza FBS aggiunto in fondo così come un chemoattractant. In parallelo, le cellule vengono coltivate LP9 soli, sotto ogni condizione di trattamento.
Analogamente, quando si studia la capacità invasiva delle cellule e sferoidi, è anche importante esaminare le loro capacità migratorie e per distinguere i due comportamenti (cioè invasione richiede la digestione proteolitica di una barriera ECM mentre la migrazione non). Per fare questo, omettere la barriera ECM (Passi 3.1.1 – 3.1.3) e condurre il test in parallelo con la barriera ECM in luogo. Quest'ultima misura 'invasione' può essere corretto al precedente provvedimento 'migrazione', se lo si desidera. Infine, è importante notare che le informazioni ottenute dalle misure di impedenza elettrica non sono complete: una volta cellule hanno invaso nella camera inferiore, cambiamenti nella loro attaccamento, la diffusione, la proliferazione e sul lato inferiore della membrana possono contribuire ai cambiamenti rea impedenzaammaccature. Pertanto, questa metodologia è più informativa se usato in combinazione con altri saggi di redditività sferoide cellulare, l'adesione, la migrazione e la morfologia al fine di valutare complessivamente comportamenti delle cellule sferoidali. Ad esempio, idealmente, al fine di comprendere appieno le interazioni sferoidali-mesoteliale, co-culture separate dovrebbero essere ripreso periodicamente al microscopio a fase standard in modo che le valutazioni qualitative della sferoide morfologia e la salute possono essere effettuate in parallelo con saggi RTCA quantitativi di invasione. Se viene eseguita la fase di etichettatura facoltativa, poi i comportamenti delle singole cellule tumorali possono essere determinate mediante microscopia a fluorescenza come disgregano dal sferoide e interagiscono con le cellule mesoteliali non marcati. Un ulteriore vantaggio di etichettatura fluorescenza delle cellule tumorali quando co-coltura con un secondo tipo di cellule è che è poi possibile confermare che solo le cellule tumorali hanno invaso le barriere cellulari ed ECM.
<p class="jove_content"> In sintesi, questo metodo rappresenta un elevato throughput analisi quantitativa di cancro ovarico sferoide invasione delle barriere mesoteliali e ECM. Attraverso l'aggiunta di citochine esogene, fattori di crescita, o inibitori specifici verso le camere superiori o inferiori della piastra CIM così, questo metodo permette una rapida determinazione dei fattori che regolano le interazioni tra cellule ovariche sferoidali cancro invasione attraverso mesoteliali e barriere Matrix oltre tempo.Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da una CASS Science Foundation e Medicina di Grant; (MB); un Health & Medical Research Council of Australia Nazionale Progetto Grant (KLS, 338.516); e Operational Support Program infrastrutture del Governo del Victoria (Australia).
Materials
| xCELLigence RTCA DP Analyser | ACEA biosciences | RTCA DP | |
| xCELLigence CIM plates | ACEA biosciences | 5665817001 | |
| Cell TraceTM CFSE | Molecular Probes | C34554 | |
| Methylcellulose (4000 centipose) | Sigma | M0512 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11966-025 | |
| Medium 199 | Life Technologies | 11150067 | |
| Ham's F-12 Nutrient mix | Life Technologies | 11765062 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 100-15 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Trypsin EDTA | Gibco-Invitrogen | 15400-054 | |
| 96-well concave culture plate | Grenier Bio-One | 650185 | |
| LP9 Human mesothelial cell line | Coriell Institute for Medical Research | AG07086 | |
| Growth Factor-reduced Matrigel matrix | BD Biosciences | 354230 |
References
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