Evaluatie van eierstokkanker Sferoïde Hechting en Invasie van mesotheelcellen in Real Time
Summary
Ovariale kankercel invasie in de mesotheellaag van het peritoneum is een dynamisch proces in de tijd. Gebruik te maken van een real-time analyzer, kan de invasieve capaciteit van eierstokkanker cellen in een bolvormige-mesothelial cel co-cultuur model gekwantificeerd worden gedurende langere perioden, het verstrekken van inzicht in factoren die de het metastatische proces.
Abstract
Eierstokkanker uitzaaien door het afstoten in de peritoneale vloeistof en verspreiden naar distale sites binnen het buikvlies. Monolaagkweken niet nauwkeurig modelleren het gedrag van kankercellen bij een hechtende omgeving kankercellen inherent aggregeren tot multicellulaire structuren die bijdragen aan het metastatische proces door aan en invasie van de peritoneale voering secundaire tumoren vormen. Voor het modelleren van deze belangrijke fase van eierstokkanker metastase, meercellige aggregaten, of bolvormige deeltjes, kunnen worden gegenereerd uit gevestigde eierstokkankercellijnen onder nonadherent voorwaarden gehandhaafd. De peritoneale micro waarmee tumorcellen in vivo na te bootsen, werd een sferoïde-mesotheelcellen co-cultuurmodel gevestigd waar voorgevormde sferoïden worden uitgeplaat op een humane mesotheelcellen cel monolaag gevormd over een extracellulaire matrix barrière. Methoden werden vervolgens ontwikkeld met behulp van een real-time cel analysator om kwantitatieve real voerentijdmetingen van het invasieve vermogen van verschillende eierstokkanker cellijnen gekweekt als sferoïden. Deze aanpak zorgt voor de continue meting van de invasie over lange perioden van tijd, wat een aantal voordelen ten opzichte van traditionele eindpunt assays en het imago meer bewerkelijke realtime microscopie analyses heeft. Kortom, deze methode maakt een snelle bepaling van factoren die de interacties tussen eierstokkanker bolvormige cellen invasie door mesothelial en matrix barrières in de tijd te regelen.
Introduction
Eierstokkanker heeft het hoogste sterftecijfer van alle gynaecologische kankers 1. Wereldwijd zijn er ~ 230.000 gevallen en meer dan 100.000 doden als gevolg van de ziekte elk jaar 1. De meeste patiënten (> 75%) zijn gediagnosticeerd na de kanker al is uitgezaaid, wanneer de behandeling verder wordt gecompliceerd door verhoogde weerstand tegen chemotherapie en de prognose is slecht 2. Patiënten met stadium III-IV gemetastaseerde ziekte hebben 5 jaarsoverleving van slechts 30-40% 3. Er is dus een dringende behoefte aan een beter inzicht in de cellulaire gedrag onderliggende eierstokkanker metastase om effectief te behandelen gevorderde ziekte.
Het huidige model van eierstokkanker metastase stelt verschillende stappen in het metastatische proces, elk plaatsvindt in een afzonderlijke micro die effecten op gedrag van de tumor. Uitzaaiende eierstokkankercellen aanvankelijk worden vergoten is van de primaire tumor en overleven in een nonadherent staat binnen de peritoneale vloeistof als enkele cellen of driedimensionale meercellige structuren, genoemd meercellige aggregaten of sferoïden 2,4,5. Cellen die niet sferoïden in suspensie behoren, zijn gevoeliger voor anoikis 2,4,5. Sferoïden ook vertonen verhoogde resistentie tegen chemotherapeutica, bijdragen aan residuele ziekte en vervolgens herhaling van kanker 2,4,5. Een tweede cruciale stap in eierstokkanker metastase is de overgang van de aggregaten van vrij zwevende clusters aan gevestigde secundaire tumoren in de peritoneale muur en omentum 5,6. Cel-cel en cel-substraat interacties zijn betrokken bij aggregaatvorming, overleving en hechting aan de extracellulaire matrix (ECM) geproduceerd door de mesotheellaag van het buikvlies 4-11. Vooralsnog zijn deze processen slecht begrepen.
Om de bij de verspreiding van eierstokkanker mechanismen te definiëren, kan sferoiden alge wordenATED van gevestigde cellijnen met behulp nonadherent kweekmethoden, behoud van cellen in suspensie, hetzij door toevoeging van methylcellulose aan het kweekmedium 12,13 of door het kweken van cellen op low-bevestigingsplaten 2,14. Wanneer gekweekt op deze manier, eierstokkankercellen assembleren tot multicellulaire aggregaten of sferoïden die soortgelijke cellulaire, moleculaire en biochemische eigenschappen met tumor aggregaten in vivo 2,14 vertonen. Na het vormen kunnen sferoïden vervolgens geoogst uit het medium en hechtend opnieuw uitgeplaat op verschillende vaste oppervlakken voor functionele studies. Dit betekent een vooruitgang ten opzichte van assays in monolaag cultuur, die daarvan niet nauwkeurig model van de gedragingen van eierstokkanker cellen uitzaaiingen binnen een nonadherent omgeving zoals de intraperitoneale vloeistof.
De invasieve capaciteit van kanker sferoïden kan worden beoordeeld in de traditionele eindpunt assays in Boyden 2 </sup>, maar deze benadering kan misleidend zijn, eierstokkanker invasie is een dynamisch proces in de tijd. Een recente real-time methode is uitgewerkt met behulp van time-lapse video microscopie van mesotheelcellen cel klaring door een invasie van eierstokkanker sferoïden 15,16; echter analyse tijdsverloop gegevens is tijdrovend en kan subjectief zijn. Hierin wordt een snelle, kwantitatieve methode om de invasieve gedrag van eierstokkanker sferoïden realtime beschreven. Ten eerste werd een bolvormige-mesothelial celmodel opgericht, die het stadium van eierstokkanker metastase vertegenwoordigt als meercellige sferoïden hechten aan en dringen het peritoneale voering om secundaire tumoren vormen. Dan methodologie voor een Real Time Cell Analyzer (RTCA, zie Materialen tabel bedrijfsinformatie) aangepast kwantitatieve real-time metingen van het invasieve vermogen van verschillende eierstokkanker cellijnen gekweekt als sferoïden en getest in dit model voeren.
In het RTCA instrument, cellulaire reacties continu gevolgd gedurende het verloop van een test, zonder dat exogene etiketten, door het meten van veranderingen in elektrische impedantie. Speciaal ontworpen kweekplaten hebben goud gecoate micro-elektroden zich onder een microporeus membraan op het grensvlak tussen de bovenste en onderste kamers van 2 goed chambered (CIM "platen). De locatie van de elektroden in de onderste kamer maakt meting van veranderingen in elektrische impedantie cellen binnendringen via een ECM of ECM / cellulaire barrière. Het membraan interface tussen de 2 kamers van elke CIM plaat goed wordt eerst bekleed met de ECM component van belang. In de sferoïde-mesotheelcellen cel modelsysteem is de interface bekleed met een laag Matrigel (zie Materialen tabel bedrijfsinformatie), de complexe ECM onderliggende mesotheellaag van het peritoneum bootsen, gevolgd door een confluente monolaag van humane mesotheelcellen ' target 'cellen. Tenslotte voorgevormde eierstokkanker sferoïden zijn advertentieDED. Eierstokkanker bolvormige cellen moeten actief binnen te dringen door de doelcellen laag en matrix om de onderste kamer te bereiken en elektrische impedantie metingen veranderen. Doelcellen als zodanig worden ook beoordeeld om te garanderen dat zij niet bedreigen via de matrixlaag en zijn geschikt voor gebruik in deze assay.
Protocol
Representative Results
Discussion
Binnenvallende eierstokkanker cellen interageren met verschillende celtypen aan het oppervlak van het peritoneum, waaronder fibroblasten, adipocyten, en mesotheelcellen en bidirectionele communicatie tussen de kankercellen en peritoneale cellen wordt gedacht een sleutelrol te vervullen bij de verdere metastasering 2. Wanneer de knie, de hierin beschreven protocol gemakkelijk aangepast aan de studie van deze interacties binnen de peritoneale micromilieu, bijvoorbeeld door de toevoeging van exogene cytokinen, groeifactoren of specifieke remmers voor de bovenste of onderste kamers van de CIM putje of genetische manipulatie van de kanker of peritoneale cellijnen. Bovendien kan deze werkwijze worden toegepast met primaire ovariale tumorcellen vers geoogst uit maligne ascites en / of primaire peritoneale cellen direct inzicht in de regulatorische signalen en cellulaire interacties die de instelling van een metastatische lesie regelen binnen de peritoneale holte krijgen <sup> 2.
Gebruik van de RTCA instrument om de invasieve capaciteit van enkele cellen of bolvormige deeltjes te meten biedt verschillende voordelen ten opzichte van conventionele single eindpunt assays en beeld time-lapse-analyses. Het RTCA instrument meet cellulaire invasie op welbepaalde tijdstippen continu in de loop van een test, die kan uren of dagen. Dit maakt de bepaling van veranderingen van de invasie van de tijd, die de beperkingen van enkele eindpunt assays overwint. Bijvoorbeeld, het onderzoeken van de invasie gegevens uit verschillende kankercellijnen bij een eindpunt (figuur 2), bijv. 3 uur, kunnen leiden tot de verkeerde conclusie dat KGN en OVCA433 cellen waren veel invasief dan OVCA429 cellen. Een ander voordeel van deze technologie is dat het RTCA instrument meet veranderingen in elektrische impedantie. Dit betekent dat de testen kunnen worden uitgevoerd zonder het labelen van cellen met een exogeen agens, die onbedoelde effecten op cel-phen kan hebbenotype of functie. Dit wordt vooral belangrijk bij het bestuderen primaire eierstokkanker cellen afkomstig van maligne ascites, waarmee het noodzakelijk om manipulaties tot een minimum om te voorkomen dat er moleculaire en fenotypische veranderingen die niet reflecterend hun in vivo aard 2. Bovendien wordt het gebruik van de RTCA instrument maakt het verzamelen van kwantitatieve gegevens in real time, die niet alleen voorkomt het tijdrovende analyses geassocieerd met time-lapse microscopie maar maakt ook de snelle bepaling van de belangrijkste experimentele vensters voor assay optimaliseren. Dit is vooral handig bij het vergelijken van de effecten van een aantal factoren op sferoïde invasie, kan als verschillende factoren hun maximale effecten op verschillende tijdstippen of met een sterk verschillende profielen in de tijd uit te oefenen.
Hoewel dit protocol is ontvankelijk voor veranderingen (bijvoorbeeld, gebruik van verschillende ECM matrix verschillende kankercellijnen, of verschillend doel cells), indien daarbij is belangrijk op te merken dat verschillende experimentele omstandigheden eerst worden geoptimaliseerd. Bijvoorbeeld, voor de aanvang van studies van sferoïde invasie, het optimale aantal kankercellen / CIM plaat goed te beginnen moet worden bepaald door analyse van het aantal cellen titraties in monolaagkweek. Het optimale aantal bolvormige deeltjes gebruikt per well wordt vervolgens op basis van deze analyse. Bijvoorbeeld, in de huidige werkwijze, Steroiden omvatten ongeveer 3000 cellen per wanneer eerst gegenereerd. Als eerste nummer cel titraties geven aan dat 30.000 cellen in monolaag zijn optimaal voor detectie in invasie analyses, vervolgens 10 bolletjes worden toegevoegd per CIM plaat ook. Bovendien, bij het uitvoeren van co-cultuur experimenten, is het van belang het gedrag van de "doel" cel monolaag bestuderen afzonderlijk om te bepalen of deze cellen zijn inherent invasief, omdat dit de resultaten kunnen verwarren. In het voorbeeld getoond, zijn kanker sferoïden geplateerd bovenop een LP9 cel monolayer, met en zonder FBS toegevoegd aan de bodem en een chemoattractant. Tegelijkertijd worden LP9 cellen alleen gekweekt, onder elke behandeling staat.
Ook wanneer het bestuderen van de invasiecapaciteit van cellen en sferoïden, is het ook belangrijk om hun trekkende capaciteiten alsook om de twee gedragingen (bijvoorbeeld invasie vereist proteolytische digestie van een ECM barrière dat migratie niet) onderscheiden onderzocht. Om dit te doen, laat de ECM barrière (stap 3.1.1 – 3.1.3) en het gedrag van de test parallel met de ECM barrière op zijn plaats. De laatste 'invasie' maatregel kan worden gecorrigeerd naar de voormalige 'migratie' maatregel, indien gewenst. Tenslotte moet worden opgemerkt dat de informatie die uit maatregelen elektrische impedantie is beperkt: zodra cellen binnengedrongen in de onderste kamer, kunnen veranderingen in de bevestiging, verspreiding en proliferatie aan de onderzijde van het membraan bijdragen tot veranderingen impedantie reaDings. Daarom is deze werkwijze is het meest informatief wanneer gebruikt in combinatie met andere testen van sferoïde cellevensvatbaarheid, adhesie, migratie en morfologie om bolvormige cel gedrag uitvoerig beoordelen. Bijvoorbeeld, idealiter, om volledig te begrijpen sferoïde-mesotheliale interacties, aparte co-culturen moeten ook periodiek worden afgebeeld onder standaard fase microscopie, zodat kwalitatieve beoordelingen van bolvormige morfologie en gezondheid kan worden gemaakt parallel met kwantitatieve RTCA testen van een invasie. Als de optionele etikettering wordt uitgevoerd, dan is het gedrag van enkele kankercellen kunnen worden onder fluorescentie microscopie bepaald als ze splitsen van de bolvormige en interactie met de ongelabelde mesotheelcellen. Een bijkomend voordeel van fluorescent labelen van de kankercellen bij co-kweken met een tweede celtype is dat het dan mogelijk is om te bevestigen dat alleen de kankercellen zijn binnengedrongen door de cel en ECM barrières.
<p class="jove_content"> Kortom, deze methode is een high throughput kwantitatieve analyse van eierstokkanker spheroïde invasie van mesotheliale en ECM barrières. Door de toevoeging van exogene cytokines, groeifactoren, of specifieke remmers voor de bovenste of onderste kamers van het CIM plaat goed, deze methode maakt een snelle bepaling van factoren die de interacties tussen eierstokkanker bolvormige cellen invasie door mesothelial en matrix barrières op te reguleren tijd.Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een CASS Stichting Wetenschap en Geneeskunde Grant; (MB); een National Health & Medical Research Council of Australia Project Grant (KLS, 338516); en door de Victoriaanse regering operationele infrastructuur Support Program (Australië).
Materials
| xCELLigence RTCA DP Analyser | ACEA biosciences | RTCA DP | |
| xCELLigence CIM plates | ACEA biosciences | 5665817001 | |
| Cell TraceTM CFSE | Molecular Probes | C34554 | |
| Methylcellulose (4000 centipose) | Sigma | M0512 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11966-025 | |
| Medium 199 | Life Technologies | 11150067 | |
| Ham's F-12 Nutrient mix | Life Technologies | 11765062 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 100-15 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Trypsin EDTA | Gibco-Invitrogen | 15400-054 | |
| 96-well concave culture plate | Grenier Bio-One | 650185 | |
| LP9 Human mesothelial cell line | Coriell Institute for Medical Research | AG07086 | |
| Growth Factor-reduced Matrigel matrix | BD Biosciences | 354230 |
References
- Ferlay, J., et al. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN. Int J Cancer. 127, 2893-2917 (2008).
- Ahmed, N., Stenvers, K. Getting to know ovarian cancer ascites: opportunities for targeted therapy- based translational research. Frontiers in Oncology. 3, (2013).
- Karst, A. M., Drapkin, R. Ovarian cancer pathogenesis: a model in evolution. J Oncol. 2010, (2010).
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. Am J Pathol. 177, 1053-1064 (2010).
- Shield, K., Ackland, M. L., Ahmed, N., Rice, G. E. Multicellular spheroids in ovarian cancer metastases: Biology and pathology. Gynecol Oncol. 113, 143-148 (2009).
- Hudson, L. G., Zeineldin, R., Stack, M. S. Phenotypic plasticity of neoplastic ovarian epithelium: unique cadherin profiles in tumor progression. Clin Exp Metastasis. 25, 643-655 (2008).
- Burleson, K. M., Boente, M. P., Pambuccian, S. E., Skubitz, A. P. Disaggregation and invasion of ovarian carcinoma ascites spheroids. J Transl Med. 4, 6 (2006).
- Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol Oncol. 93, 170-181 (2004).
- Burleson, K. M., Hansen, L. K., Skubitz, A. P. Ovarian carcinoma spheroids disaggregate on type I collagen and invade live human mesothelial cell monolayers. Clin Exp Metastasis. 21, 685-697 (2004).
- Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin. J Clin Invest. 118, 1367-1379 (2008).
- Kenny, H. A., Nieman, K. M., Mitra, A. K., Lengyel, E. The First Line of Abdominal Metastatic Attack: Breaching the Mesothelial Cell Layer. Cancer Discov. 1, 100-102 (2011).
- Hattermann, K., Held-Feindt, J., Mentlein, R. Spheroid confrontation assay: a simple method to monitor the three-dimensional migration of different cell types in vitro. Ann Anat. 193, 181-184 (2011).
- Laib, A. M., et al. Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo. Nat Protoc. 4, 1202-1215 (2009).
- Latifi, A., et al. Isolation and characterization of tumor cells from the ascites of ovarian cancer patients: molecular phenotype of chemoresistant ovarian tumors. PLoS One. 7, (2012).
- Davidowitz, R. A., Iwanicki, M. P., Brugge, J. S. In vitro mesothelial clearance assay that models the early steps of ovarian cancer metastasis. J Vis Exp. (60), (2012).
- Iwanicki, M. P., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discov. 1, 144-157 (2011).
- Nishi, Y., et al. Establishment and characterization of a steroidogenic human granulosa-like tumor cell line, KGN, that expresses functional follicle-stimulating hormone receptor. Endocrinology. 142, 437-445 (2001).
- Xu, F., et al. The outcome of heregulin-induced activation of ovarian cancer cells depends on the relative levels of HER-2 and HER-3 expression. Clin Cancer Res. 5, 3653-3660 (1999).
