在实时的间皮细胞卵巢癌球体附件和入侵评估

细胞的准备工作1。，媒体和试剂含甲基纤维素 – 中的制备溶解1.5克甲基纤维素在250毫升的烧瓶用100ml无菌的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（无添加剂）的。 加热，在微波5分钟，在低的溶液;小心避免沸腾了。 一旦甲基纤维素粉末是半溶解后，加一个干净的磁力搅拌器和媒体采取的体积至125ml。 混合，反转，并在室温下搅拌1.5小时，随后在4℃下搅拌过夜。 平分的解决方案分为四个50ml试管和离心1.5小时在2,300×g的。 收集清，高粘度上清液（股票约90-95％），分装到无菌的50ml试管，并储存在4℃可保存3个月。 文化与细胞的标记保持在单层卵巢癌细胞系中的TiSSUE培养箱中，在37℃，5％CO 2在适当的生长培养基（DMEM为KGN单元17和MCBD110：M199为OVCA429和OVCA433细胞系18），补充有10％胎牛血清（FBS），2mM的L -谷氨酰胺和1％青霉素 – 链霉素。 保持LP9人类间皮细胞在M199：火腿含有F12培养基15％FBS，10毫微克/毫升的表皮生长因子（EGF）和400毫微克/毫升氢化可的松，在培养箱中在37℃，5％CO 2。 种子细胞中的所需烧瓶大小和生长至约75％汇合。用0.05％胰蛋白酶/ EDTA，旋在186×g离心5分钟，并用PBS洗涤细胞沉淀物两次收获的细胞用胰蛋白酶消化。 使用血细胞计数器计数细胞。 可选的荧光细胞标记方法重悬癌症细胞以1×10 6个细胞/ 1毫升预热的PBS/0.1％BSA中的溶液的最终浓度。 加入2μl的5毫米的股票手机风帆王牌CSFE溶液（或保持长期其它优选的细胞标记）的细胞，以10μM的终浓度和孵育在37℃水浴中10-15分钟。 淬火用1ml冰冷的培养基中含有10％FBS和再沉淀通过离心分离该反应。重悬在10毫升的适当预热的生长培养基（见步骤1.2.1）。 种子细胞成75 厘米过滤器覆盖的烧瓶中，并培养于37℃，5％CO 2。 检查在荧光显微镜下观察细胞，确认荧光标记的电平足够进行检测。一旦细胞达到约75％汇合，收获和计数按照步骤1.2.3和1.2.4以上。 球体的2。在生成甲基纤维素计算从第1卵巢癌细胞所需的球体产生的（共300000细胞的每个都需要完整的96孔板实验）的体积。无TE：如果使用不同的细胞系比这里提出，细胞密度为均匀的球体产生，可能需要对每行进行优化。 计算稀释细胞甲基媒体，首先减去15毫升要求（步骤2.1）的细胞体积。 加3的甲基股票溶液（使20％的甲基纤维素最终）至体积的培养基适合于每个细胞系，等于15毫升减去细胞体积和轻轻翻转充分混合。 新增300,000细胞含有甲基纤维素中，轻轻颠倒充分混匀。 吸移管150微升的细胞/甲基纤维素/媒体组合（总共3000个细胞/孔的）到一个96孔的凹底培养板中，培养在37℃下的每一个孔的，5％CO 2中培养1-4天，或直到均匀球体组成（1球体/孔通常观察到的）。 3，RTCA细胞侵袭实验 NOTE：阻抗读数被表达为细胞指数（CI），一个无量纲参数，它是在表示单元的状态测量电池阻抗的相对变化。为了便于分析，数据导入到电子表格中，例如Microsoft Excel。 板准备工作中的4个孔组的时间，加50μl的基质（稀释于无血清培养基中1:10），一个16 – 孔RTCA CIM板的上部腔室的每个孔中，以确保总表面积被覆盖。立即取出30微升矩阵，但慢慢地，摆脱任何多余的液体。 培养板在37℃下，在组织培养箱中在使用前4小时。 加适合于每个细胞系的上部腔室和160微升的媒体有或无血清（按您的实验设计）的下部腔室30微升无血清培养基（SFM）中。 通过点击下部腔室入上腔体和equilibr装配在CIM平板吃在37℃培养箱中培养1小时在组织培养的孵化器。 编程RTCA仪器打开RTCA程序，并选择“布局”选项卡。突出显示所有实验井。 右键单击井，并选择“打开井”;然后根据需要填写的实验条件和单元名称。 要添加步骤或子步骤的程序，选择“添加了一步”的“时间表”标签并点击右键。第一个步骤是预编程的背景扫描，它会自动并入程序一次'添加步骤“被选择。 输入所需的程序细节的RTCA方案，该方案将建立LP9单层的过程中录制的读数步骤2。通过选择“间隔”选项卡，进入'15分钟'添加阻抗读数之间的时间间隔。增加实验时间通过选择“持续时间”选项卡中的ð进入12-24小时之间的时间。 要添加后续步骤中，选择“添加了一步”的“时间表”选项卡，右键点击并输入的额外步骤的详细信息，如上。在RTCA程序步骤3将直接仪球体入侵期间采取读数;输入'下'的'时间'标签下间隔“选项卡，'48小时''5分钟。 选择'板'在菜单栏上，并保存。 球体入侵LP9单层和计量的产生从上面的步骤3.2将CIM板RTCA仪器和开放的程序。在添加单元格，选择“执行”菜单栏中，然后“开始”。背景扫描将自动执行（步骤1中的RTCA软件的说明）。 从仪器下面的后台扫描和地方组织培养罩取下CIM板。 板50,0悬浮00 LP9细胞在160微升的SFM到每个CIM板的上部腔室良好。 将板在RTCA仪器，并采取读数，每15分钟，同时LP9单层建立过夜（RTCA该计划的步骤2）。 下步'在甲基纤维素球体的一代“2收成产生癌症的球体，上面。 在无菌条件下，切1毫米销1毫升移液管尖的顶部，并用它来轻轻地检索每个的内容很好。转移到无菌管中。 离心机的球状体，在120×g离心8分钟，并且通过温和抽吸除去含有甲基纤维素培养基中。 用PBS两次洗球体，在离心120×g离心8分钟每次洗涤后沉淀的球体。 对于每个实验的井，在160微升培养基中的无FBS重悬，共10球状体。 通过选择菜单栏中的“执行”，并检查与暂停的RTCA实验＃8216;暂停“。从仪器上取下CIM板，并将其放置在组织培养罩。吸断从每个孔中的介质，并替换为椭球体的含介质（10球在160微升）或LP9只对照孔新鲜培养基。 返回板的RTCA仪器。选择菜单栏中“执行”，并选中“中止一步”。该程序会自动移动到下一个步骤。要继续实验，然后从菜单栏中“执行”，并勾选“开始/继续”。在RTCA程序步骤3将启动。 数据分析以确定球体细胞侵袭的程度，减为LP9单层仅由为在每个时间点的卵巢癌细胞系中获得的单个读数得到的值。 绘制'球体入侵'，归一化的所有值在该球体被添加到板的时间点，由s廷该时间点为'0'。