설립과 연구에 높은 처리량 설정 최적화<em> 표피 포도 구균</em>와<em> Mycobacterium의 박테</em> 감염 신약 개발의 모델로

본 결과는 높은 처리량의 파이프 라인은 S.을 연구하는 것을 보여 표피와 M. 박테 감염이 성공적으로 설립되었습니다하고 다른 감염 모델로 확장 할 수있다. 첫째, Adatto 외 의해 발행 시스템에 기초 큰 사육 용기 (도 1a). (2011) (11)의 사용은, 산란 과정의 높은 제어를 수득 한 이벤트에 동기 계란의 큰 숫자를 생성 할 수있다. 이전에 개발 한 자동화 된 마이크로 분사 장치 (7)의 향상된 버전 (도 1a)를 사용하고, 단기간에 많은 수의 배아를 주입 할 수있을 다음. 노른자 감염에 대한 가장 발달 단계, S.로 주사되는 당나귀하려면 표피와 M. 박테는 킴멜 등에 의해 제 설명에있어서, (1) 및 (512) 세포 단계 사이의 모든 다른 단계에서 수행되었다. (1995) 12 </suP>. 100 CFU S.와 주사 표피는 16과 128 세포 단계 사이에 가장 감염 패턴 (그림 2)을 제공했다. 박테리아는 3 일 동안 노른자 내부 확산 및 이후 3 dpi로부터 몸에 퍼졌다. 256 세포 단계의 배아의 체내 확산 거의 모든 박테리아와 노른자 내에서 주로 세균의 성장을 보여준 후 16 세포 단계 전에 주사를 수행하면 4 dpi로, 사출에서 높은 사망률했다. 세균 부담 정량 비네 등에 의해 설명 된 큰 입자는 유동 세포 계측기 형광 강도 분석에 의해 수행되었다. (2013) 13 (도 3). 관찰 보여 주었다 (30) CFU M.의 주입을위한 최적의 발달 단계 박테 주입 E11 변형 (그림 4A)과 더 많은 악성 M의 strai와 16-64 세포 단계 사이에 16-128 세포 단계 사이N (그림 4B). 이 단계에서 주입 된 배아는 노른자 내부의 박테리아의 성장을 보여 배아 (그림 7)을 통해 박테리아의 확산. 이전 단계에서 두 균주 감염은 4 dpi로 후 죽을 배아를 선도하는 특이 현상이 일반화 된 박테리아의 성장을 제시했다. 한편, 이후 단계에서 주입 된 배아 세균 부담 노른자위로 제한 하였다. 다음으로, 큰 입자와 사전 정렬 (그림 1B)은 비 또는 높은 감염 배아 (도 5A 및 6A)을 제외하고 감염된 물고기의 큰 동질 그룹을 생성 흐름 cytometer. 사전 정렬 한 후, M. 박테 감염된 태아는 리팜피신, 첫 번째 줄의 항결핵제로 치료했다. 이전 연구는 200 μM의 복용량에서 리팜피신과 치료가 효율적으로 M.를 감소 시킨다는 것을 보여 주었다 제브라 피쉬의 7, 13 박테 감염. advantag를 촬영다른 용량이 수행 된과 높은 처리량을 설치, 치료 생성 균일하게 감염 배아의 많은 수의 전자. M.에 감염된 태아 박테 M의 긴장과 12, 24, 48 시간 동안 처리하고, 200 μM 리팜피신은 용량 의존적으로 (그림 5B)에 효율적으로 마이코 박테리아 감염을 줄일 수 있었다. 이 농도는 실험에 미래에 사용 된 200 μM의 용량으로 리팜피신을 이용한 감염의 효과적인 저감의 관점에서. 이전 결과와 일치, 세균 부담의 진행을 공부하는 것은 M.를 사용하여 박테 E11 변형은 크게 감소 24 시간 이후부터는 200 μM 리팜피신과 치료 후 (그림 6B)이 관찰되었다. 고배율 촬상 이들 배아 필요한 경우 또한, 이들은 샘플 사용하여 분석 할 수있는 96 – 웰 플레이트 (도 1C)에 자동으로 표시 할 수있다큰 입자 샘플러와 척추 자동 선별 기술 시스템은 CLSM에 장착. 큰 입자 샘플러와 척추 자동 선별 기술 시스템은 하나 CLSM 또는 스테레오 현미경에 장착 할 수있는 시스템입니다. 이 장치는 자동 유리 모세관을 통해 96 – 웰 플레이트 또는 벌크 컨테이너로부터 라이브 또는 고정 배아의 로딩을 허용하고, 원하는 각도 (예를 들면, 등쪽 또는 측 방향)에서 카메라 앞에서 그것을 놓고 방향. 모든 방향에서 배아의 이미지는 보드에 카메라 또는 외부 CLSM (그림 7)로 할 수있다. 배아는 이후 수집 또는 폐기물 용기에 전송됩니다. 그림 1. 메인 스트림 실험 어서 나와이네. 큰 별) 성인 물고기는 계란, 수집 아가 플레이트에 정렬 및 주입, 짝짓기를 함께 넣어. B)가 주입 된 계란 28 ° C에서 배양하고 가능한 약물 치료에 대한 사전 정렬됩니다. C) 후속 분석 입자가 CLSM으로 세포 계수기 및 / 또는 큰 입자 샘플러 / 척추 자동 선별 기술 흐름. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. S. 가장 세포 단계의 2. 설립도 표피 주입 노른자. 제브라 피쉬 배아 S. 100 CFU로 1 512 세포 단계에서 서로 다른 발달 단계에서 노른자에 주입했다 표피. 1 사이에 주입 배아ND 8 세포 단계 4 dpi로의 노른자와 높은 사망률에 박테리아의 성장을 보였다. 16 128 세포 단계 사이에 주입 배아는 노른자와 3 dpi로 시작되는 몸 안에 박테리아의 성장을 보였다. 256 및 512 세포 단계 사이에 주입 배아는 노른자 안에 많은 박테리아의 성장을 보였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. S.의 사이토 큰 입자의 흐름을 이용하여 세균 부담의 그림 3. 정량화. 100 CFU 표피는 제브라 피쉬 배아의 노른자에 주입 하였다.) 5 dpi의, 매일, 10 배아의 그룹이 두 생물 복제 (오차 막대를 기준으로 평균 기하 급수적 인 성장을 보여, 균질화 직접 도금했다분석 사이토 = SEM). B) 큰 입자의 흐름은 비 – 주입 S.에서 평균 형광 신호를 도시 표피는 배아를 주입했다. .하지 유의 한 차이 C) CFU 사이의 상관 관계 : 조건 당 30-160 배아 (오차 막대는 = SEM), 다른 문자는 ANOVA는 Tukey의 사후 테스트 (P <0.001), NS 뒤에 하나의 방법으로 통계 학적으로 유의 한 차이를 나타냅니다 분석 하였다 (10) S. 그룹의 평균 형광 신호 표피는 (오차 막대 = SEM) 배아를 감염. 이 그림은 비네 등에서 수정되었습니다. (2013) 8. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 4. EstablisM.에 가장 적합한 세포 단계의 hment 박테 노른자 주입. 제브라 피쉬 배아 M. 30 CFU로 1 512 세포 단계에서 모든 다른 발달 단계에 주입 하였다 박테 E11와 M의 변형.는, B) 배아 보여 1-8 세포 단계에서 주입 유사한 확산과 사람들은 주사하는 동안 E11 균주 육아종 및 전신 감염의 형성을 보여 주었다으로 두 균주 사망.) 태아는 16-128 세포 단계 사이에 주입 256 ~ 512 세포 단계가. B) 노른자로 세균의 부담을 보관에서 태아 512 세포 단계 128에서 분사 사람들은 노른자로 세균의 부담을 유지하면서 구조 및 전신 감염 등 육아종의 형성을 보여 주었다 M 변형으로 16-64 세포 단계 사이에 주입 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 5" fo: src = "/ files/ftp_upload/51649/51649fig5highres.jpg""> : FO 내용 너비 = "5 인치" 그림 5. M. 치료 박테 급성 감염은 첫줄 항 결핵 약물. 배아 M. 30 CFU로 16-64 세포 단계 사이에 주입 박테 M의 변형은 두 그룹에서 개별 배아의 비 및 / 또는 높은 감염 배아.) ​​형광을 폐기 한 후 두 그룹으로 분류 될 수있는 3 dpi로에서의 유동 세포 계측기에 큰 입자를 통해 실행했다. B) 태아는 리팜피신 (RIF로 치료 ) 12, 24, 200 μM이 4 dpi로에서 분석 하였다 투여 48 시간 동안; 자신의 세균 부하가 크게. C에게) 대표 COPAS (12), (24)의 복용에 DMSO와 리팜피신 처리 배아의 프로필 및 24 시간 200 μM을 줄일 수있다. 세균 하중 분포는 빨간색 피크로 표시됩니다. 블루 라인은 제브라 피쉬 전자 DPF 정렬 된 요소의 프로필 (4를 나타냅니다mbryo) COPAS로. 조건 당 60 ~ 90 배아를 분석 하였다. 각 데이터 포인트는 개별 배아를 나타낸다. ± SEM 의미로 값이 표시됩니다. NS : 유의하지 차이. 차이의 통계적 유의성 분석은 ANOVA는 Tukey의 posthoc 테스트 뒤에 하나의 방법에 의해 수행되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 6. M. 치료 박테 만성 감염은 첫 번째 줄의 결핵 약물. 배아 M. 30 CFU로 16-64 세포 단계 사이에 주입 박테 E11 균주 비 및 / 또는 높은 감염 배아를 폐기 한 후 두 그룹으로 분류 될 수있는 3 dpi 해상도에서 사이토 큰 입자의 흐름을 통해 실행되었습니다. A) 두 그룹에서 개별 배아의 형광. B) 사일 동안 200 μM에서 리팜피신 (RIF)으로 처리 태아가 치료의 일일 후 세균 부하의 상당한 감소를 보여 분석 하였다. 조건 당 90 배아를 분석 하였다. ± SEM 의미로 값이 표시됩니다. 다른 문자는 같은 치료의 시점 사이에 유의 한 차이를 나타냅니다. * 대조군과 유의 한 차이를 나타냅니다. NS : 유의하지 차이. 차이의 통계적 유의성 분석은 ANOVA는 Tukey의 posthoc 테스트 뒤에 하나의 방법에 의해 수행되었다. (P <0.05). 그림 B)가 Spaink 등에서 수정되었습니다. (2013) 13. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. hres.jpg "SRC ="/ files/ftp_upload/51649/51649fig7.jpg "/> M.의 그림 7. 결과 박테 E11 노른자 주입 척추 자동 선별 기술 및 CLSM을 사용하여 몇 군데. 5 dpi로 fli1-EGFP 14 배 (3 이미지를 손바느질) 공 촛점 Z 스택을. M.의) 라이브 배아 보여주는 확산 몸. B에 걸쳐 박테 E11 박테리아 (빨간색)) M.를 나타내는 고정 5 dpi로 FLI-EGFP 배아 몸 전체 박테 E11 박테리아 (빨간색) 백혈구 L-plastin 15을 면역 염색에 의해 감지 (밝은 파란색)와 공동 지역화.