Statische Adhesie Assay voor de Studie van Integrine Activering in T-lymfocyten
Summary
Statische adhesietest is een krachtig instrument dat kan worden gebruikt om het model van interacties tussen T-lymfocyten en andere celtypes. Interacties worden gegenereerd door het injecteren gelabelde T-cellen in putjes bekleed met adhesiemoleculen, terwijl een plaatlezer wordt gebruikt om het aantal hechtende cellen te kwantificeren na seriële wasbeurten.
Abstract
T lymfocyt adhesie vereist voor meerdere T-celfuncties, waaronder migratie naar plaatsen van ontsteking en vorming van immunologische synapsen met antigen presenterende cellen. T-cellen bereiken gereguleerde hechting door het regelen van de hechting van integrinen, een klasse van celadhesie moleculen die bestaan uit paren van heterodimere transmembraan eiwitten die interageren met doelmoleculen op partner cellen of extracellulaire matrix. De meest prominente T-cel integrine is lymfocytfunctie geassocieerd antigeen (LFA) -1, bestaande uit subeenheden aL en β2, waarvan het doel is de intracellulaire adhesie molecuul (ICAM) -1. Het vermogen van een T-cel adhesie controle afgeleid van de mogelijkheid om de affiniteit status van afzonderlijke integrines regelen. Inside-out signalering beschrijft het proces waarbij signalen binnen een cel ertoe leiden dat de externe domeinen van integrines aan een geactiveerde toestand aannemen. Veel van onze kennis van deze complexe fenomenen is gebaseerd op mechanistischestudies uitgevoerd in vereenvoudigde in vitro modelsystemen. T lymfocyten adhesieanalyse hier beschreven is een uitstekende tool waarmee T-cellen zich te houden aan doelwitmoleculen, onder statische omstandigheden, en vervolgens maakt gebruik van een fluorescerende plaat lezer om hechting te kwantificeren. Deze test is nuttig geweest bij het bepalen adhesie-stimulerende of remmende stoffen die op lymfocyten, en karakterisering van de signalerende gebeurtenissen betrokken. Hoewel de hier beschreven LFA-1 – ICAM-1 gemedieerde adhesie; Deze bepaling kan gemakkelijk worden aangepast om voor de studie van andere bindingsinteracties (bijvoorbeeld VLA-4 – fibronectine).
Introduction
T lymfocyt adhesie is een fundamenteel proces in de immuunrespons 1. Het is noodzakelijk voor T-cel interactie met endotheelcellen versieren de capillaire wanden, scannen antigeen presenterende cellen (APC) in lymfklieren, en voor de vorming van immunologische synapsen (IS) met doelcellen 2. Deze eisen zijn functioneel en kinetisch onderscheiden. Het proces van lymfocyten extravasatie bestaat uit chemoattractie, rollende, stevige adhesie en transmigratie. De overgang van rollen om de hechting stevig vereist T-cellen om snel te reageren op een G-eiwit gekoppelde receptor signaal. Deze reactie levert een integrine ligand interactie die vertraagt en arrestaties de glooiende cel 3. Een onmiddellijke wijziging van integrine aviditeit bemiddelt dit proces. Migratie vereist dynamische interacties betweenTcells en endotheelcellen met de vorming van verklevingen bij de 'voorkant' en breuk van verklevingen aan de 'achterkant'met een interval van een minuut tussen vormen en breken 4. De IS vormt inminutes, maar moet intact blijven voor uren 6.
Interessant, een adhesiemolecuul, het integrine familielid lymfocytfunctie geassocieerd antigeen (LFA) – 1, is essentieel voor al deze processen 5. LFA-1 bemiddelt adhesie door interactie met diverse leden van de immunoglobuline superfamilie. De meest uitgebreid bestudeerde ligand met de hoogste affiniteit voor LFA-1 is de intercellulaire adhesiemolecuul (ICAM) -1. Niet-geactiveerde circulerende lymfocyten lage affiniteit LFA-1 aan het celoppervlak, en daarom niet houden aan ICAM-1-gecoate oppervlakken. LFA-1 affiniteit is variabel en wordt gereguleerd door verschillende signalering evenementen zoals G-eiwit gekoppelde receptor activering, cytokinestimulatie en signalen gemedieerd door T-cel-receptoren (TCR). De resulterende hoge affiniteit vorm van LFA-1 brengt intracellulaire activering naar de extracellulaire ruimte through interactie met ICAM-1. Deze route wordt genoemd inside-out signalering 7. Ook signaleren door LFA-1 uit de extracellulaire ruimte wordt outside-in signalering genoemd.
De intracellulaire signalering cascades betrokken bij inside-out en outside-in signalering zijn een belangrijke focus van het huidige onderzoek. De kleine GTPase Rap1 is onlangs naar voren gekomen als de belangrijkste component van inside-out te geven dat gemeenschappelijk is voor zowel TCR ligatie en cytokine signalering 8. De cruciale rol van Rap1 in integrine activering wordt benadrukt door de ontdekking dat overexpressie van Rap1 stimuleert integrine-afhankelijke adhesie van T-cellen, terwijl T-cel adhesie wordt geblokkeerd door expressie van dominant negatieve Rap1 9. Deze vooruitgang in ons begrip van integrine regulering door Rap1 zijn bereikt middels in vitro gereedschap. Onder hen is de statische adhesietest beschreven.
Het algemene doel van deze methode is om T studerencel hechting aan ICAM-1 gecoate oppervlakken. Meer in het bijzonder, wordt het gebruikt om objectief te meten en te kwantificeren LFA-1 affiniteit naar zijn teller liganden in levende cellen in real-time, onder verschillende omstandigheden. Deze techniek maakt gebruik van polystyreen wells gecoat met ICAM-1 de cellulaire oppervlakken die de T-cellen interageren met nabootsen. Veel eerder beschreven statische T cel adhesie assays experimenteel complex. Deze vaak nodig voor T-cellen assays radioactief worden gelabeld, gebruikt gekweekte runder corneale cellen een extracellulaire matrix te maken als substraat voor T celadhesie of opgevraagd voor niet-fysiologische T-cel stimulatie over een langere periode T-cel adhesie 10 bevorderen. Het gebruik van fluorometrische meting om T-cellen te kwantificeren na de hechting incubatie is een meer gevoelige en nauwkeurige werkwijze voor kwantificering opzichte cytometrie microscopie en stroom, zoals worden gebruikt in vele andere testsystemen 11. Daarnaast enkele cel microscoopic analyse van integrine lokalisatie niet mogelijk voor de brede populatie gebaseerde analyse op dezelfde manier als de fluorometrische meting. Terwijl activeringstoestand specifieke LFA-1-antilichamen zijn commercieel verkrijgbaar, deze antilichamen bieden lage gevoeligheid ten opzichte van de hier beschreven methode. Het voordeel boven alternatieve techniek is zijn eenvoud en de mogelijkheid om meerdere proefomstandigheden parallel onderzoek. Bij het overwegen van deze methode voor een specifieke toepassing, moet men rekening houden dat T-cellen negatief worden gekozen, vers geïsoleerd en gelabeld met een fluorescente merker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn verschillende assays om signalen te bestuderen LFA-1 activatie en T celadhesie 12. Flowcytometrie wordt gebruikt voor LFA-1 affiniteit staten meten levende cellen met monoklonale antilichamen die selectief binden aan hetzij gebogen of uitgebreide LFA-1. Een van de beperkingen van deze methode is dat het geen rekening met de aviditeit integrinen. Migratie assays zijn nuttige hulpmiddelen, maar ze meten migratie, en niet miezerig hechting op een specifiek tijdstip. Muismodellen voor T-lymfocyten migrati…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hirschil Trust, Michael Saperstein Medical Research Scholars fondsen, en de NYU Whitehead fellowship dit werk ondersteund.
Materials
| Plate reader | BioTek | Synergy H1 Hybrid | |
| Multichannel pipette | Fisher | 21-377-829 | |
| 96-well microplate with optical bottom | Corning Costar | 3603 | |
| Recombinant ICAM-1 | R&D Systems | ADP4-050 | |
| Anti-CD3 antibodies | Ancell | 144-020 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| CFSE | Molecular Probes | C1157 | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| DPBS containing calcium and magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Peripheral lymphocytes | e.g. mouse or human | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 499609 | |
| Open Gen 5 software | BioTek | Version 2.01 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| 15 and 50 mL centrifuge tubes | Fisher | 352099, 352070 | |
| Disposable plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| T-75 culture flasks | Fisher | 50-754-1366 | |
| RosetteSep T cell enricment kit | StemCell Technologies | 15061 |
References
- Dustin, M. L., et al. Membranes as messengers in T cell adhesion signaling. Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).
- Mor, A., et al. GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling. Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).
- Rose, D. M., et al. Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration. Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).
- Alon, R., Feigelson, S. W. Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts. Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).
- Griffith, J. W., Luster, A. D. Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies. Eur J Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).
- Dustin, M. L. Cell adhesion molecules and actin cytoskeleton at immune synapses and kinapses. Curr Opin Cell Biol. 19 (5), 529-533 (2007).
- Springer, T. A., Dustin, M. L. Integrin inside-out signaling and the immunological synapse. Curr Opin Cell Biol. 24 (1), 107-115 (2012).
- Mor, A., et al. D1 regulates lymphocyte adhesion via upregulation of Rap1 at the plasma membrane. Mol Cell Biol. 29 (12), 3297-3306 (2009).
- Bivona, T. G., et al. Rap1 up-regulation and activation on plasma membrane regulates T cell adhesion. J Cell Biol. 164 (3), 461-470 (2004).
- Zeltzer, E., et al. Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin. Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).
- Bhattacharyya, S. P., et al. Both adhesion to immobilized vitronectin and Fc epsilon RI cross-linking cause enhanced focal adhesion kinase phosphorylation in murine mast cells. Immunology. 98 (3), 357-362 (1999).
- Dustin, M. L., Groves, J. T. Receptor signaling clusters in the immune synapse. Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).
