Estática Adesão Ensaio para o Estudo da integrina Ativação em Linfócitos T

Linfócitos T aderência é um processo fundamental para a resposta imune ^1. É necessário para a interacção das células T com as células endoteliais decoração nas paredes dos capilares, para o antigénio de células apresentadoras de varrimento (APC) dentro de nódulos linfáticos, e para a formação de sinapses imunológicas (IS), com células-alvo ^2. Estes requisitos são funcionalmente e cineticamente distintas. O processo de linfócitos extravasamento consiste quimioatração, rolamento, adesão firme e transmigração. A transição a partir de rolamento para firmar aderência requer as células T de responder a um sinal de receptor acoplado a proteína G rapidamente. Esta resposta produz uma interação ligante integrina que retarda e prisões da célula de rolamento ^3. Uma mudança imediata na avidez integrina medeia este processo. A migração requer interacções betweenTcells dinâmicos e células endoteliais com a formação de aderências no 'front end "e quebra de aderências no' extremidade traseira 'com um intervalo de cerca de um minuto entre a formação e quebra ^4. O IS constitui inminutes, mas precisa permanecer intacta por horas ^6.

Curiosamente, uma molécula de adesão, a função de membro da família de linfócitos integrina antígeno associado (LFA) – 1, é essencial para todos estes processos ^5. LFA-1 medeia a adesão através de interacções com vários membros da superfamília das imunoglobulinas. O ligando mais extensivamente estudado com a mais elevada afinidade para o LFA-1 é a molécula de adesão intercelular (ICAM) -1. Linfócitos circulantes não-activadas expressam baixa afinidade de LFA-1 na superfície das células, e, por conseguinte, não são capazes de aderir a superfícies revestidas de ICAM-1. LFA-1 é de afinidade variável e regulada por vários eventos de sinalização, tais como a proteína G acoplado a activação do receptor, estimulação de citoquinas, e os sinais mediados pelos receptores das células T (TCR). A forma de afinidade elevada, resultante da LFA-1 transmite activação intracelular para o espaço extracelular tinteracções hrough com ICAM-1. Este caminho é chamado de dentro para fora sinalização ^7. Do mesmo modo, a sinalização através de LFA-1 a partir do espaço extracelular é chamado de fora para dentro de sinalização.

O cascatas de sinalização intracelular envolvidas na de dentro para fora e de fora para dentro de sinalização são um grande foco de pesquisa atual. A pequena GTPase Rap1 surgiu recentemente como o componente chave de dentro para fora sinalizando que é comum a ambos ligadura TCR e citocina sinalização ^8. O papel crítico da Rap1 na activação de integrina é realçada pela descoberta de que a sobre-expressão de Rap1 estimula a adesão dependente de integrina de células T, enquanto que a adesão de células T é bloqueada através da expressão de Rap1 dominante negativa ^9. Esses avanços em nossa compreensão da regulação integrina por Rap1 ter sido realizado utilizando em ferramentas vitro. Entre elas, está o ensaio de adesão estático descrito aqui.

O objetivo geral deste método é estudar Tadesividade de células a ICAM-1 as superfícies revestidas. Mais especificamente, é utilizado para medir e quantificar objectivamente LFA-1 de afinidade para com os seus ligandos de contador em células vivas em tempo real, sob diferentes condições. Esta técnica utiliza poços de poliestireno revestidas com ICAM-1, para imitar as superfícies celulares que as células T interagem com. Muitos ensaios de adesão de células T estático anteriormente descritos foram experimentalmente complexo. Estes ensaios frequentemente requeridos para as células T a ser marcado radioactivamente, utilizado células da córnea de bovino em cultura para criar uma matriz extracelular como o substrato para a aderência das células T, ou chamados para a estimulação não-fisiológico de células T durante um período prolongado para promover a adesão de células T ^10. A utilização de medição fluorométrico para quantificar as células T após a incubação de adesão é um método mais sensível e precisa de quantificação, em comparação com a citometria de fluxo e microscopia, que são utilizados em muitos outros sistemas de ensaio ^11. Além disso, uma única célula microscopic análise de integrina localização não permite a ampla, a análise da população com base na mesma maneira como a medição f luorométrica. Enquanto que os anticorpos específicos do Estado de LFA-1 de activação estão comercialmente disponíveis, estes anticorpos oferecer uma baixa sensibilidade em relação com o método descrito aqui. A principal vantagem sobre as técnicas alternativas é a sua simplicidade e a capacidade de analisar múltiplas condições experimentais simultaneamente. Ao considerar este método para uma aplicação específica, deve-se levar em conta que as células T devem ser selecionados de forma negativa, recentemente isolado, e marcadas com um marcador fluorescente.