Комплексный анализ транскрипции Dynamics от мозга образцов После поведенческой Опыт

Динамичной организацией мозгом позволяет когнитивные и поведенческие гибкость. Опыт кодируются путем изменения структуры и прочности связей между нейронами в мозге ^3. Это "опыт-зависимой пластичности" является результатом индукции специфических форм генной экспрессии, что обеспечивает необходимые белки для модификации синаптической структуре и прочности ^4. Идентификация генов регуляторных сетей посредником образование долгосрочной памяти является центральным принципом молекулярной нейробиологии, с ожиданием, что идентификация доминирующих элементов транскрипционных программ обеспечит понимание основных принципов, регулирующих формирование памяти, а также целевые показатели для лечение нейродегенеративных и психоневрологических расстройств. Транскрипции программы развернется в временно-определенных волн, каждая из которых кодирует гены разного характера, которые важны для гifferent этапы реализации исхода данного события сигнализации ^1,2. Поэтому важно, чтобы обратиться транскрипционные динамику на детальном временном масштабе времени, с тем чтобы определить полный набор генов, индуцированных, и разобраться в их потенциальной функции в соответствии с динамикой их индукции.

Наркомания является надежной формой зависящей от опыта пластичности, вызванного долговременными последствиями злоупотреблением наркотиками на нейронных цепей в мозгу ^5,6. Начальное, острое воздействие препаратов может привести к развитию наркомании и переход к хроническим использования. Контекстной информации является ключевым элементом в развитии наркомании. Связанных с наркотиками средовые сигналы назначаются важное значение в сознании наркоманов. Контекстная информация напоминая наркоманом прошлого опыта наркотиков может вызывать рецидив к наркотиков тягу даже после длительных периодов воздержания от наркотиков воздействия ^7,8.Поэтому великий клинической проблемой в зависимости – склонность наркоманов к рецидиву даже долгое время после снятия симптомов убыль ^9.

Поведенческая сенсибилизация к кокаину является простая модель кокаина опыта полезной при изучении механизмов наркомании. В этом широко изученной модели для длительной сенсибилизации, вызванной хроническим воздействием наркотиков, вызывающих зависимость, грызуны сначала приучали к засоленных инъекций (внутрибрюшинными; IP) в новой среде (открытой полевой камеры, в которой их двигательную активность контролируется) ; Затем, они получают ежедневные инъекции кокаина в камерах открытом пространстве в то время как их деятельность контролируется ¹⁰ (рисунок 1). Это поведенческая парадигма обычно приводит в прочном сенсибилизации поведения опорно-двигательного (8-12 раз выше базовой деятельности) ^11, который ведется в течение нескольких месяцев после прекращения приема кокаина инъекций, демонстрируя образование извращенецasive след памяти опыта наркотиков.

Нейронная схема вознаграждения, естественно участие в укреплении поведения, необходимые для успеха того или иного вида (например, подачи, секс), эксплуатируется злоупотреблением наркотиками укрепления наркотиками связаны с поведением ^12,13. Молекулярные и клеточные механизмы, с помощью которых опыт злоупотреблением наркотиками усиливается, кажется, похожи на механизмы, лежащие образование декларативных или семантических воспоминаний в других структурах мозга ^14. Таким образом, надежность поведенческой модели сенсибилизации делает его привлекательным модельную систему для изучения механизмов зависящей от опыта пластичности.

Прилежащем ядре (NAC) является центральным интегратор награду схемы мозга, и была широко ассоциируется с развитием наркомании ^5,6. Формирование наркомании зависит от транскрипции новых белков в прилежащем ядре, и надежная вводство четко структурированных программ транскрипции наблюдается в NAc следующие кокаина опыта ^15-19. Острая транскрипции ответ на воздействия кокаина, вероятно, работать на нескольких уровнях для того, чтобы адаптироваться к сильной индукции стимула и направить производство новых белков, которые несут ответственность за структурные и электрофизиологических изменений, вызванных воздействием препарата ^6,19-22.

В целях содействия изучению молекулярных механизмов зависящей от опыта пластичности в мозге, протокол описывается для всестороннего анализа динамики транскрипции в пробах мозговой ткани следующем поведенческой манипуляции. Протокол иллюстрируется в контексте поведенческой опыта исследуемой в лаборатории Citri – поведенческой чувствительности к кокаину, используя микрофлюидных динамические массивы для транскрипции анализа. Протокол описано, очевидно, не ограничивается изучением тОн прилежащем ядре в контексте поведенческой сенсибилизации, но может быть применен к большому числу поведенческих парадигм и областей головного мозга. В самом деле, этот протокол может быть применен к ткани тела вне мозга, а также различные опыте или манипуляций организма изучены.

Протокол грубо разделить на четыре стадии. На первом этапе, животное подвергают поведенческой парадигмы; на втором этапе ткань микродиссекции; на третьем этапе – мРНК очищенная, обратной транскрипции и зондируют, и на конечной стадии данные анализируются.

В контексте изучения транскрипционных динамику, точные сроки и определение опыта, вероятно, наиболее важные экспериментальные параметры для управления. По этой причине, наша модель поведения выбора является то, что поведенческой чувствительности к кокаину, системы, которая обеспечивает высокую степень контроля над экспериментатора параметров experienсе. Дополнительные поведенческие парадигмы, которые позволяют точное время и решению различных моделей зависящей от опыта пластичности или формирования памяти доступны. Эти модели включают страх кондиционирование ^23, острый экологической обогащения ^24,25, по исследованию объекта роман ²⁶ и визуальный опыт следующую темной воспитания ^27. Тем не менее, поведенческая сенсибилизация к кокаину является последовательно надежный поведенческая манипуляции, создавая весьма распространенной след памяти, которая длится в течение нескольких месяцев после кокаина опыт ^28.

Мозг подразделяется последующим ручным микродиссекции прилежащем ядре. Это был наш опыт, что руководство микродиссекции от быстро подготовленных срезах мозга обеспечивает самый надежный и быстрый метод извлечения ткани, необходимой для поведенческой парадигмы, и с опытом, границы ткани становится очевидной и легко распознаваться. Кроме того, тонкие ломтики может быть ДГОред, затем лазер-захвата микродиссекции. Хотя этот метод позволяет высоко определяется разграничение интересующей области, это очень медленный процесс (что может привести к потере лабильного мРНК), утомительно и требует дорогостоящего специализированное оборудование (микроскоп, оснащенный лазерной установки захвата). Протокол определено здесь также может быть адаптирована к одноклеточного транскрипции анализа, ручной аспирации цитоплазме визуально выявленных клеток с использованием патч пипетки ^29. Важно отметить, что протокол, описанный обеспечивает среднем населения, в то время как весьма вероятно, что в большинстве случаев, только субпопуляции клеток в ткани на самом деле участвует в борьбе с опытом. Представляет интерес к профилю транскрипцию выборочно, изнутри конкретных клеточных популяций, принявших участие в опыте, но обсуждение этих подходов выходит за текущей области.

Для очистки мРНК, с обратной транскрипцией и КПЦР Запросы, тканинарушается, пропуская ее через тонкие иглы, с последующим использованием коммерчески доступных наборов (для получения дополнительной информации, табл 8). Выбор сообщается опытом с этих методологий, обеспечивающих надежную экстракцию высокой РНК качества и надежных результатов последующих применений.

Хотя протокол описан для высокой пропускной кПЦР используя динамические массивы, образцы могут быть проверены экспрессии генов с помощью конечной точки ПЦР, с низкой пропускной КПЦР, генные микрочипы выражения или глубоко секвенирования. Предпочтение высокой пропускной КПЦР с использованием динамических массивов связано с тем, что мРНК, полученной из ядер головного мозга следующие поведенческие парадигмы часто предельных величин. Динамические массивы обеспечить платформу, которая позволяет эффективно всесторонний анализ транскриптов из большого количества параллельных образцов в одном эксперименте. После первоначального приобретения микрожидкостной системы (обычно институциональной о.е.rchase), эксперименты являются относительно недорогими для запуска. После этого анализа, дальнейшее Запрос образцов может быть выполнена с использованием более дорогостоящих платформ для поиска новых транскриптов (на микрочипов или RNAseq) с динамические массивы предоставление всеобъемлющей информации для обеспечения качества. Наконец, для анализа данных, стандартные методы используются. Конкретные указатели, касающиеся вопросов, которые могут возникнуть, будут обсуждены в тексте протокола.

Этот протокол является наиболее подходящим для следователей, заинтересованных в тщательного расследования их системы интересов, обучающихся несколько условий и повторов. Протокол также наиболее подходящий для следователей, которые уже отточенные в (через микрочипов или RNAseq экспериментов) на подмножестве 50-500 интересующих генов, которые они заинтересованы в запросе неоднократно.