Umfassende Analyse der Transkription von Gehirnproben Dynamics folgenden Verhaltens Experience

Dynamische Organisation des Gehirns ermöglicht kognitive und Verhaltensflexibilität. Erfahrungen werden durch Modifikationen der Struktur und Festigkeit der Verbindungen zwischen Neuronen im Gehirn ³ kodiert. Diese "Erfahrung abhängige Plastizität" ist das Ergebnis der Induktion von spezifischen Mustern der Genexpression, die die notwendigen Proteine ​​enthält zur Modifikation der synaptischen Struktur und Festigkeit ^4. Die Identifikation von Gen-regulatorischen Netzwerke der Vermittlung der Bildung von Langzeiterinnerungen ist ein zentraler Grundsatz der molekularen Neurowissenschaften, mit der Erwartung, dass die Identifizierung der dominierenden Elemente der Transkriptionsprogramme Einblick in die Grundprinzipien der Regulierung der Gedächtnisbildung sowie Ziele für bieten Behandlung von neurodegenerativen und neuropsychiatrischen Störungen. Transkriptionsprogramme entfalten in zeitlich definierten Wellen, die jeweils Gene kodieren unterschiedlichen Charakters, die für different Stufen der Umsetzung der Ergebnisse des Signalisierungsereignis ^1,2. Es ist daher wichtig, Transkriptions Dynamik auf einer detaillierten Zeitskala anzugehen, um so das volle Komplement von Genen induziert identifizieren, und einen Einblick in die Potentialfunktion entsprechend der Dynamik der Induktion.

Drogenabhängigkeit ist eine robuste Form der Erfahrung abhängige Plastizität durch die lang anhaltende Wirkung von Drogen auf neuronale Schaltkreise im Gehirn verursacht ^5,6. Initial, akute Exposition gegenüber Drogen, kann zur Entwicklung von Sucht und den Übergang zur chronischen Anwendung führen. Kontextinformationen ist ein wesentliches Element in der Entwicklung von Sucht. Drug-assoziierte Umweltreize sind von großer Bedeutung in den Köpfen der Drogenabhängigen zugeordnet. Kontextinformationen erinnert einen Drogenmissbrauch in der Vergangenheit Drogenerfahrung kann Rückfall in Drogenverlangen auslösen, auch nach längerer Abstinenz von Arzneimittelexposition ^7,8.Daher die große Herausforderung in der klinischen Sucht – die Neigung zu Rückfällen von Süchtigen auch lange nach Entzugserscheinungen haben ⁹ nachgelassen.

Verhaltenssensibilisierung Kokain ist ein einfaches Modell von Kokain Erfahrung bei der Untersuchung von Mechanismen der Drogenabhängigkeit. In dieser weit untersuchten Modell für die langfristige Sensibilisierung durch chronische Exposition gegenüber Drogen induziert werden Nagetiere erste Kochsalzinjektionen (intraperitoneale; IP) gewöhnt in einer neuen Umgebung (einem offenen Feld Kammer, in der ihre Bewegungsaktivität wird überwacht) ; dann, tägliche Injektionen von Kokain erhalten sie in den offenen Bereich Kammern während ihrer Tätigkeit überwacht ¹⁰ (Abbildung 1). Diese Verhaltens Paradigma führt typischerweise zu einem robusten Sensibilisierung der Bewegungsverhalten (8-12 fach über Grundaktivität) ^11, die für einen Zeitraum von Monaten nach Beendigung der Kokain-Injektionen erhalten bleibt, was die Bildung einer PERVasive Speicher Spur von Drogenerfahrung.

Die neuronalen Schaltkreise der Belohnung, natürlich bei der Verstärkung Verhalten wesentlich für den Erfolg einer Spezies (zB Fütterung, Geschlecht) beteiligt sind, wird von Drogenmissbrauch Drogen-assoziierten Verhaltensweisen verstärken ^12,13 ausgebeutet. Die molekularen und zellulären Mechanismen, durch die Erfahrung von Drogen verbessert scheinen ähnlich zu den Mechanismen der Bildung von deklarativen oder semantische Speicher in anderen Gehirnstrukturen ¹⁴ zugrunde, sein. Daher ist die Robustheit des Verhaltenssensibilisierung Modell macht es zu einem attraktiven Modellsystem, um Mechanismen der erfahrungsabhängigen Plastizität zu studieren.

Die Nucleus accumbens (NAC) ist eine zentrale Integrator des Gehirns Lohn-Schaltung, und wurde ausgiebig mit der Entwicklung von Sucht ^5,6 verbunden. Die Bildung von Sucht hängt Transkription neuer Proteine ​​in dem Nucleus accumbens und robustProduktion von klar strukturierten Transkription Programme ist in der folgenden NAc Kokain Erfahrung ^15-19 beobachtet. Die akute Reaktion auf Kokain Transkriptions Gefahr besteht, dass auf mehreren Ebenen, um der starken Induktionsreiz anzupassen und die Produktion neuer Proteine ​​lenken Funktion, die sind für die strukturelle und elektrophysiologische Veränderungen durch die Einwirkung der Droge ^6,19-22 induzierte verantwortlich.

Um die Untersuchung der molekularen Mechanismen der erfahrungsabhängige Plastizität im Gehirn zu fördern, ist ein Protokoll für die umfassende Analyse der Transkription Dynamik der Hirngewebeproben folgenden Verhaltensmanipulation beschrieben. Das Protokoll wird im Rahmen des Verhaltens Erfahrung studierte in den Citri Labor veranschaulicht – Verhaltens Sensibilisierung auf Kokain, Verwendung mikrofluidischen dynamische Arrays für die Transkriptionsanalyse. Das beschriebene Protokoll ist selbstverständlich nicht auf das Studium t begrenzter Nucleus accumbens im Rahmen von Verhaltenssensibilisierung, könnte aber zu einer Vielzahl von Verhaltensparadigmen und Hirnregionen aufgebracht werden. Tatsächlich könnte dieses Protokoll, um Körpergewebe außerhalb des Gehirns angewendet werden, und eine Vielzahl von Erfahrungen oder Manipulationen des Organismus untersucht.

Das Protokoll wird grob in vier Stufen unterteilt. Im ersten Schritt wird das Tier an den Verhaltensparadigma unterzogen; in der zweiten Stufe das Gewebe microdissected; im dritten Schritt – mRNA gereinigt, revers transkribiert und sondiert, und in einem letzten Schritt werden die Daten analysiert.

Im Rahmen der Untersuchung Transkriptionsdynamik, der genaue Zeitpunkt und die Definition der Erfahrung sind die wohl wichtigsten Versuchsparameter zu steuern. Aus diesem Grund ist, dass der Verhaltens Sensibilisierung auf Kokain, ein System, das hohe Niveau der Experimentator Steuerung ermöglicht über die Parameter der Erfah unsere Verhaltensmodell der Wahlce. Zusätzliche Verhaltensparadigmen, die präzises Timing aktivieren und sprechen verschiedene Modelle der erfahrungsabhängigen Plastizität oder Gedächtnisbildung zur Verfügung stehen. Diese Modelle sind mit Angst Anlage ^23, akute Umweltanreicherung ^24,25, Roman Objekt Exploration ²⁶ und visuelles Erlebnis folgenden dunklen Aufzucht ^27. Noch, Verhaltenssensibilisierung Kokain ist ein konsequent robuste Verhaltensmanipulation, die Schaffung eines hochdurchdringende Gedächtnisspur, die für Monate nach Kokain Erfahrung dauert ^28.

Das Gehirn wird geschnitten, gefolgt von einer manuellen Mikrodissektion des Nucleus accumbens. Es ist unsere Erfahrung, dass die manuelle Mikrodissektion aus schnell zubereitet Hirnschnitten bietet die zuverlässige und schnelle Methode der Extraktion der relevanten Verhaltens Paradigma Gewebe und mit der Erfahrung, die Grenzen des Gewebes deutlich werden und ohne weiteres zu erkennen. Alternativ könnte feine Scheiben prepar seinED, gefolgt von Laser-Mikrodissektion. Obwohl dieses Verfahren ermöglicht hoch definierten Abgrenzung des Bereichs von Interesse, es ist langsam (also zu riskieren, die labilen mRNA), mühsam und erfordert teure Spezialausrüstung (ein Mikroskop mit einem Laser-Capture-Einrichtung vorhanden ist). Die hier definierten Protokoll könnte auch auf Einzelzelltranskriptionsanalyse durch manuelle Aspiration von Zytoplasma der Zellen visuell identifiziert mit Patch-Pipetten ²⁹ angepasst werden. Es ist wichtig zu beachten, dass das beschriebene Protokoll sieht eine Bevölkerung Durchschnitt, ist es sehr wahrscheinlich, dass in den meisten Fällen nur eine Subpopulation von Zellen innerhalb des Gewebes tatsächlich in Reaktion auf die Erfahrung beteiligt. Es ist von Interesse, um die Transkription in selektiver Weise aus bestimmten Zellpopulationen als Reaktion auf die Erfahrungen Profil, aber Diskussion dieser Ansätze ist, über den aktuellen Bereich.

Für die mRNA-Reinigung, Reverse-Transkription und qPCR Abfrage, das Gewebewird, indem es durch feine Nadeln, gefolgt von der Nutzung von kommerziell erhältlichen Kits gestört (für weitere Informationen siehe Tabelle 8). Die Wahl wird von Erfahrungen mit diesen Methoden, die zuverlässige Extraktion von hochwertigen RNA und robuste Ergebnisse von Downstream-Anwendungen zu gewährleisten informiert.

Während das Protokoll wird für die Hochdurchsatz-qPCR beschriebenen Verwendung dynamische Arrays können Proben für die Genexpression mittels Endpunkt-PCR, geringe Durch qPCR, Genexpression-Microarrays oder tiefe Sequenzierung untersucht werden. Die Präferenz für die Hochdurchsatz-qPCR unter Verwendung dynamischer Anordnungen ist aufgrund der Tatsache, dass die mRNA erhalten aus Hirnkernen folgenden Verhaltensparadigmen ist oft der begrenzende Mengen. Dynamische Arrays eine Plattform, die eine effiziente umfassende Analyse der Transkripte aus einer großen Anzahl von Proben parallel in einem einzigen Experiment ermöglicht. Nach der anfänglichen Erwerb des mikrofluidischen Systems (allgemein institutioneller purchase), sind Experimente relativ preiswert zu laufen. Nach dieser Analyse könnten weitere Abfrage der Proben durchgeführt unter Verwendung teurer Plattformen, um für neue Transkripte (von Microarrays oder RNAseq) mit den dynamischen Arrays eine umfassende Referenz für die Qualitätssicherung zu suchen. Schließlich ist für die Datenanalyse, Standardansätze genutzt. Konkrete Hinweise über Probleme, die auftreten können, werden in dem Text des Protokolls erörtert.

Dieses Protokoll ist für die Ermittler interessiert in einer gründlichen Untersuchung ihres Systems von Interesse, das Studium mehrere Bedingungen und Wiederholungen am besten geeignet. Das Protokoll ist auch am besten geeignet für die Ermittler, die bereits in (durch Microarray-Experimente oder RNAseq) auf einer Teilmenge von 50-500 Gene von Interesse, die sie interessiert sind Abfragen wiederholt geschliffen haben.