Uitgebreide analyse van de transcriptie van Brain Dynamics Monsters Na Behavioral Experience

Dynamische organisatie van de hersenen in staat stelt cognitieve en gedragsmatige flexibiliteit. Ervaringen worden gecodeerd door wijzigingen in de structuur en sterkte van verbindingen tussen neuronen in de hersenen ^3. Deze "ervaringsafhankelijke plasticiteit" is het resultaat van inductie van specifieke patronen van genexpressie die de benodigde eiwitten voorziet modificatie van synaptische structuur en sterkte ^4. De identificatie van gen-regulatorische netwerken via de vorming van lange-termijn geheugen is een van de kernelementen van de moleculaire neurowetenschappen, met de verwachting dat de identificatie van de dominante elementen van de transcriptie-programma inzicht zal geven in de fundamentele beginselen die vorming van het geheugen, maar ook doelen voor behandeling van neurodegeneratieve en neuropsychiatrische aandoeningen. Transcriptionele programma ontvouwen in temporeel gedefinieerde golven, die elk coderen voor genen van andere aard, die belangrijk zijn voor different momenten in de uitvoering van de resultaten van de signalering evenement ^1,2. Het is daarom belangrijk om transcriptionele dynamiek richten op een uitgebreide tijdelijke tijdschema, teneinde de volledige complement van genen geïnduceerd identificeren en inzicht in de potentiële functie volgens de dynamiek van de inductie.

Drugsverslaving is een robuuste vorm van ervaring-afhankelijke plasticiteit veroorzaakt door de langdurige effecten van drugs op de neurale circuits in de hersenen ^5,6. Eerste, acute blootstelling aan middelen kan leiden tot de ontwikkeling van verslaving en de overgang naar chronisch gebruik. Contextuele informatie is een cruciaal element in de ontwikkeling van verslaving. Drugs geassocieerd omgevingsfactoren zijn groot belang toegekend in de hoofden van drugsgebruikers. Contextuele informatie herinneren een drugsgebruiker van verleden drugservaring kan terugval naar drugs verlangen opwekken, zelfs na lange periodes van onthouding van drugs blootstelling ^7,8.Vandaar de grote klinische uitdaging in verslaving – de neiging van verslaafden om nog lang recidief na ontwenningsverschijnselen zijn verdwenen ^9.

Sensitisatie is een eenvoudig model van cocaïne ervaring nuttig voor de studie van de mechanismen van drugsverslaving. In deze breed bestudeerde model voor de langdurige sensibilisatie veroorzaakt door chronische blootstelling aan drugs worden knaagdieren eerst gewend aan saline injecties (intraperitoneaal, IP) in een nieuwe omgeving (open veld kamer waarin de locomotorische activiteit bewaakt) ; dan krijgen ze dagelijkse injecties van cocaïne in het open veld kamers terwijl hun activiteit bewaakt ¹⁰ (figuur 1). Deze gedrags paradigma resulteert typisch in een robuuste sensibilisatie van locomotorische gedrag (8-12 voudig boven uitgangswaarde activiteit) ^11, die gedurende een periode van maanden na beëindiging van cocaïne injecties, waaruit de vorming van een pervasive geheugen sporen van drugs ervaring.

De neurale circuits van de beloning, van nature betrokken bij het ​​versterken van het gedrag van essentieel belang voor het succes van een soort (bijvoorbeeld voeding, geslacht), wordt uitgebuit door drugs tot drugs geassocieerd gedrag ^12,13 versterken. De moleculaire en cellulaire mechanismen die de ervaring van misbruik van drugs wordt versterkt lijken op de mechanismen die ten grondslag liggen aan de vorming van declaratieve of semantische herinneringen in andere hersenstructuren ¹⁴ te zijn. Daarom is de robuustheid van de sensitisatie model maakt het aantrekkelijk modelsysteem mechanismen ervaring plasticiteit onderzoeken.

De nucleus accumbens (NAC) is een centrale integrator van de hersenen van de beloning circuits, en is uitgebreid in verband met de ontwikkeling van verslaving ^5,6. De vorming van verslaving afhankelijk transcriptie van nieuwe eiwitten in de nucleus accumbens en robuustductie van duidelijk gestructureerde transcriptie programma's wordt waargenomen in de NAC volgende cocaïne ervaring ^15-19. De acute transcriptionele respons op blootstelling aan cocaïne is waarschijnlijk om te functioneren op verschillende niveaus om aan te passen aan de sterke inductie stimulans en om de productie van nieuwe eiwitten die zijn verantwoordelijk voor de structurele en elektrofysiologische veranderingen geïnduceerd door blootstelling aan het geneesmiddel ^6,19-22.

Om de studie van moleculaire mechanismen ervaring plasticiteit van de hersenen te bevorderen, wordt een protocol beschreven voor de uitgebreide analyse van transcriptie dynamica in hersenweefsel monsters na gedragsbeïnvloeding. Het protocol wordt weergegeven in de context van de gedrags ervaring bestudeerd in de Citri lab – sensitisatie, gebruik microfluïdische dynamische arrays voor transcriptionele analyse. De beschreven protocol is uiteraard niet beperkt tot het bestuderen thij nucleus accumbens in de context van sensitisatie, maar kan worden toegepast op een groot aantal gedragsparadigma's en hersengebieden. In feite kan dit protocol worden toegepast lichaamsweefsels buiten de hersenen en diverse ondergaat of manipulaties van het organisme onderzocht.

Het protocol is ruwweg verdeeld in vier stappen. In de eerste stap wordt het dier blootgesteld aan de gedrags paradigma; in de tweede stap het weefsel gemicrodissecteerde; in de derde stap – mRNA wordt gezuiverd, reverse getranscribeerd en gemerkt, en in de laatste stap de gegevens worden geanalyseerd.

In de context van transcriptionele dynamiek bestuderen, de precieze timing en definitie van de ervaring zijn waarschijnlijk de belangrijkste experimentele parameters te controleren. Daarom onze gedragsmodel keuze is die van sensitisatie, een systeem dat hoge experimentator regelaar maakt over de parameters van de experience. Bijkomende gedrags-paradigma's die precieze timing en adressen te activeren verschillende modellen van ervaring-afhankelijke plasticiteit of vorming van het geheugen beschikbaar zijn. Deze modellen zijn voorzien van angst conditionering ^23, acute kooiverrijking ^24,25, nieuw object exploratie ²⁶ en visuele ervaring volgende donkere opfok ^27. Toch sensitisatie is een solide en samenhangend gedrags manipulatie, waardoor een sterk doordringende geheugen trace die duurt maanden na cocaïne ervaring ^28.

De hersenen is verdeeld, gevolgd door handmatige microdissectie van de nucleus accumbens. Het is onze ervaring dat handmatige microdissection van snel voorbereid hersenplakjes biedt de meest betrouwbare en snelle methode voor het extraheren van het weefsel aan de gedrags-paradigma relevant, en met ervaring, de grenzen van het weefsel zichtbaar worden en dat makkelijk te herkennen. Als alternatief zou fijne plakjes prepar zijned, gevolgd door laser-microdissectie. Hoewel deze methode maakt het mogelijk zeer gedefinieerde afbakening van de regio van belang, het is traag (en dus het risico van verlies van labiele mRNA), vervelend en vereist dure speciale apparatuur (een microscoop voorzien van een laser-capture setup). Het protocol hierin gedefinieerd kan ook worden aangepast om eencellige transcriptionele analyse handmatig aspiratie van cytoplasma visueel geïdentificeerde cellen middels patch pipetten ^29. Het is belangrijk op te merken dat de beschreven protocol verschaft een populatiegemiddelde, terwijl het zeer waarschijnlijk dat in de meeste gevallen slechts een subpopulatie van de cellen in het weefsel daadwerkelijk betrokken als reactie op de ervaring. Het is van belang transcriptie profileren selectieve wijze vanuit specifieke celpopulaties reageren op de ervaring, maar bespreking van deze benaderingen is dan de huidige scope.

Voor mRNA-zuivering, reverse-transcriptie en qPCR opvragen, het weefselwordt verstoord door het door fijne naalden, gevolgd door het gebruik van in de handel verkrijgbare kits (voor meer informatie, zie Tabel 8). De keuze wordt geïnformeerd door de ervaring met deze methodieken, die betrouwbare extractie van hoge kwaliteit RNA en robuuste resultaten van downstream-toepassingen te verzekeren.

Terwijl het protocol beschreven voor high-throughput qPCR behulp dynamische arrays kunnen monsters worden gesondeerd genexpressie middels eindpunt PCR, low-throughput qPCR genexpressie microarrays of diepe sequencing. De voorkeur voor high-throughput qPCR behulp dynamische arrays komt door het feit dat mRNA verkregen hersenkernen volgende gedragsparadigma's vaak beperken hoeveelheden. Dynamische arrays bieden een platform dat efficiënte uitgebreide analyse van transcripten mogelijk maakt uit een groot aantal parallelle monsters in een enkel experiment. Na de eerste overname van de microfluïdische systeem (meestal een institutionele purchase), experimenten relatief lage bedrijfskosten. Naar aanleiding van deze analyse, kan verdere bevraging van de monsters worden uitgevoerd met behulp duurder platforms om te zoeken naar nieuwe transcripties (door microarrays of RNAseq) met de dynamische arrays bieden een uitgebreide referentie voor kwaliteitsborging. Tenslotte, voor gegevensanalyse, standaard benaderingen worden gebruikt. Specifieke aanwijzingen met betrekking tot problemen die zich kunnen voordoen zal in de tekst van het protocol worden besproken.

Dit protocol is het meest geschikt voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in een grondig onderzoek van hun systeem van belang, het bestuderen van meerdere voorwaarden en herhalingen. Het protocol is ook het meest geschikt voor onderzoekers die reeds in zijn aangescherpt (door middel van microarray of RNAseq experimenten) op een subset van 50-500 genen van belang, dat ze geïnteresseerd zijn in herhaaldelijk bevragen.