Monte Preparação Plano de observação e análise de amostras de embriões Zebrafish manchado por inteiro Monte<em> Em situ</em> Hibridização
Summary
O embrião de peixe-zebra é um excelente modelo para investigação em biologia do desenvolvimento. Durante a embriogênese, peixe-zebra desenvolver com uma massa de gema, que apresenta desafios tridimensionais para observação de amostras e análise. Este protocolo descreve como criar bidimensionais planas montagem preparações de toda montagem in situ (desejo) manchadas espécimes embrião de peixe-zebra.
Abstract
O embrião de peixe-zebra agora é comumente usado para a pesquisa básica e biomédica para investigar o controle genético dos processos de desenvolvimento e modelar anomalias congênitas. Durante o primeiro dia de vida, o embrião do peixe-zebra progride através de vários estágios de desenvolvimento, incluindo a fertilização, clivagem, a gastrulação, segmentação, e a organogénese de estruturas, tais como o rim, coração e sistema nervoso central. A anatomia de um jovem embrião de peixe-zebra apresenta vários desafios para a visualização e análise dos tecidos envolvidos em muitos desses eventos porque o embrião se desenvolve em associação com uma massa de gema rodada. Assim, para uma análise precisa e imagem de fenótipos experimentais em amostras embrionárias fixadas entre o tailbud e 20 somite fase (10 e 19 horas após a fertilização (hpf), respectivamente), como as coradas utilizando toda montagem de hibridização in situ (desejo), ele é muitas vezes desejável remover o embrião da gema btodos e para posicioná-la plana sobre uma lâmina de vidro. No entanto, a realização de um procedimento de montagem plana pode ser tedioso. Portanto, bem-sucedido e eficiente plano de montagem de preparação é muito facilitada através da demonstração visual da técnica de dissecação, e também ajudou usando reagentes que auxiliam no tratamento de tecido ideal. Aqui, nós fornecemos o nosso protocolo DESEJO para a detecção de uma ou duas cores da expressão do gene no embrião de peixe-zebra, e demonstrar como o processo de montagem plana pode ser realizada neste exemplo de um espécime fixos manchadas. Este protocolo de montagem plana é amplamente aplicável ao estudo de muitas estruturas embrionárias que surgem durante o desenvolvimento precoce de peixe-zebra, e pode ser implementada em conjunto com outros métodos de coloração realizados em amostras de embrião fixos.
Introduction
O peixe-zebra, Danio rerio, tornou-se um organismo largamente utilizado no estudo da biologia do desenvolvimento. Zebrafish estão tropicais, espécies de vertebrados de água doce pertencente à família Cyprinidae. Zebrafish foram originalmente usado para a pesquisa ambiental para obter informações sobre os riscos potenciais de poluentes da água, como eram facilmente obtidos, barato e fácil de manter um. Ao longo dos últimos trinta anos, o peixe-zebra tornou-se reconhecido como um sistema modelo de vertebrados geneticamente tratável por uma série de razões. Zebrafish mostram um alto grau de conservação anatômica e fisiológica com vertebrados superiores, incluindo mamíferos 2,3. Anotação recente sequência do genoma revelou que aproximadamente 70% dos genes humanos têm, pelo menos, um peixe-zebra contraparte 4. Por exemplo, muitos genes ortólogos que desempenham um papel importante durante o desenvolvimento do rim foram identificados entre estas espécies 5-7. Este dramatic grau de conservação no que diz respeito à biologia celular e molecular tem possibilitado aos pesquisadores para criar modelos para uma ampla gama de doenças humanas no peixe-zebra 8 e zebrafish tornaram-se uma ferramenta valiosa para identificar potenciais terapias medicamentosas usando telas genéticos químicas 9.
Além disso, o modelo de zebrafish não só é capaz de recapitular uma variedade de processos de desenvolvimento complexos e estados de doença que são vistos em humanos, mas vários atributos adicionais também aumentam o seu apelo como um organismo modelo para estudos de embriologia. Zebrafish são ovíparos e se reproduzir através de desova de transmissão, o que fornece aos pesquisadores, com fácil acesso aos embriões desde o início da fertilização 10. Outras vantagens incluem o tamanho do embrião, transparência e desenvolvimento rápido, externo 10. Além disso, o peixe-zebra adultos possuem alta fecundidade e normalmente produzem relativamente grandes tamanhos de embreagem que pode variar entre 200-500por semana, em última análise, permitindo aos pesquisadores a realização de experimentos de alto rendimento, como telas químicas fenótipo base, com facilidade 9.
Mesmo assim, apesar da infinidade de vantagens que são exibidos pelo modelo peixe-zebra, há desafios que dizem respeito à análise e comunicação dos resultados experimentais obtidos a partir de estágios iniciais de desenvolvimento. Em alguns casos, a anatomia inerente do embrião do peixe-zebra pode obscurecer a visualização de um dos dados. Após a fecundação, a célula inicial passa por vários eventos de clivagem como o desenvolvimento progride 11. Seguindo a gastrulação, o eixo embrionário surge na fase tailbud (10 CGA) tal que ele é enrolado à volta da gema 11. Como desenvolvimento posterior avança ao longo do período de segmentação, o tronco vai crescer em massa e também prolongar por alongamento axial de tal modo que uma cauda, juntamente com uma porção do saco vitelino em si estendem para fora a partir do centro de massa de gema11. Entre o tailbud e 20 fase somito (hpf 19), as tentativas para observar características específicas do desenvolvimento, após a utilização de vários protocolos de coloração, como desejar, pode ser um desafio, tanto para visualizar e fotografia, devido à geometria do embrião e opacidade o saco vitelino. Uma maneira de eliminar esses desafios é retirar a gema e depois achatar o embrião para uma amostra de duas dimensões que pode ser analisada de uma forma mais simples.
Os seguintes recursos de protocolo e de vídeo fornecem um guia para saber como deyolk sucesso e plana montar um embrião após fixação e coloração, usando o exemplo de uma ou duas cores DESEJO coloração. Desejo é uma técnica amplamente utilizada que permite a detecção de ácidos nucleicos específicos em amostras conservadas e, portanto, permite que o sítio (s) de expressão do gene a ser detectado nos tecidos. DESEJO técnicas têm sido extensivamente descritas, e pode ser realizada com vários substratos de cores, bem como a gripeOs sistemas de detecção orescent 12-20. Aqui nós fornecemos o nosso protocolo DESEJO modificado usado para embriões de peixe-zebra entre os tailbud e segmentação estágios de desenvolvimento. Protocolos alternativos DESEJO, no entanto, são compatíveis com o processo de montagem descrito aqui plana, como se referiu no início do protocolo abaixo. Além disso, a montagem plana pode ser utilizado em conjunção com qualquer número de técnicas de visualização existentes, como por exemplo imuno-histoquímica conjunto de montagem, ou etiquetas de rastreamento de linhagem celular, que não são descritos neste protocolo. No geral, a técnica de montagem plana pode permitir uma melhor análise superior e apresentação dos dados obtidos a partir de experimentos com os primeiros estágios do desenvolvimento embrionário no peixe-zebra.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafish têm provado ser um organismo modelo extremamente valioso em toda a comunidade de pesquisa nos últimos anos. Zebrafish apresentam um elevado grau de conservação genética com a dos vertebrados superiores e vantagens pertinentes à sua anatomia, reprodução e ciclo de vida desta espécie fazem muito passíveis de análises experimentais. Além disso, o avanço das técnicas moleculares aplicáveis para o peixe-zebra promoveu ainda a utilização deste organismo modelo na pesquisa científica. Por exemplo, uma grande variedade de linhas de zebrafish transgênicos foram gerados para estudar a progressão da doença e para responder a muitas questões fundamentais que estão por trás dos mecanismos-chave do desenvolvimento, incluindo a organogênese.
Por conseguinte, com base na utilização dinâmica de peixe-zebra em ambas as doenças e de desenvolvimento da pesquisa, as metodologias de marcação de células e quantificação do sinal é um aspecto importante da análise dos dados. Enquanto os métodos que empregam uma fluorescentetibodies pode ser usado para detectar a expressão da proteína em peixes-zebra transgénicos, os investigadores geralmente dependem de procedimentos padrão como DESEJOS 12-16 para examinar a localização espaço-temporal dos transcritos do gene em uma amostra de peixe-zebra não transgénico fixo. Na verdade, o desejo é uma das técnicas mais utilizadas em biologia 16, e é uma ferramenta vital para caracterizar o fenótipo de mutações genéticas e perturbações genéticas químicos. No entanto, o desejo é associado com um número de potenciais armadilhas e desafios. Para confirmar a especificidade do anti-sentido ribroprobe, ribossondas de sentido pode ser utilizado como um controlo para avaliar a especificidade dos padrões de coloração ribossonda anti-sentido. Enquanto secções 4 e 5 são apresentados na ordem de rotulagem e a detecção de uma sonda marcada com digoxigenina seguido de sonda marcada com f luoresceina, esta ordem pode ser invertida. Tipicamente, os sinais mais fracos (genes com níveis de expressão inferiores) são melhor detectadas com sondas marcadas com digoxigenina e esta manchadesenvolvido pela primeira vez com um substrato roxo, seguido de detecção e coloração do sinal mais forte (mais gene abundantemente expresso), utilizando o substrato vermelho. No entanto, no caso de reacções de duas cores vai ser realizada, recomenda-se que várias combinações de rótulos e substratos são testados para encontrar o procedimento que é mais adequado para a recolha de dados e análise. Além disso, os tempos previstos de bloqueio, incubação do anticorpo e lavagem fornecidas nas seções 4-5 são adaptados para os embriões com menos de 24 horas após a fertilização; longos intervalos de estes mesmos passos com embriões mais velhos pode levar ao acúmulo de sal na amostra. Extensas dicas para solução de problemas DESEJO embrião de peixe-zebra padrão já foram documentados na literatura 12-16. Provavelmente o dilema mais comum é a alta fundo. Recomendamos o aumento do número de lavagens MABT no passo 4,7 para 15-20 lavagens, se necessário, no entanto, em nossa experiência, a adição do MABT overnight 'super-lavagem'dá excelentes resultados quando utilizado em conjunto com 10 ou mais lavagens MABT curtos, antes de prosseguir para a etapa 4.8. Outro exemplo dilema é pobre infiltração da sonda, que pode ocorrer com longas ribosondas. Shearing o riboprobe seguinte Passo 3.6 através da hidrólise alcalina pode contrariar esta situação. Em nossa experiência com amostras pequenas, corte sonda não é normalmente necessária. No entanto, deve-se ter em mente que os parâmetros como isso pode ser factores que contribuem para o resultado de um experimento de desejo, e sugerimos exame destas instruções de solução de problemas úteis já disponíveis ao público na Comunidade, conforme necessário para refinar os parâmetros experimentais para DESEJO em seu próprio pesquisa 12.
Em adição às técnicas tradicionais DESEJO 12-16, tem havido um surgimento contínuo de avanços nas metodologias de desejo e protocolos alternativos que têm sido formuladas. Estes incluem novos modos de detecção de sinal, tais como através da utilização de fluorescênciacência 17-19, de métodos que permitem a localização de microRNAs 20. Mesmo assim, apesar das muitas melhorias que foram feitas aos métodos de rotulagem celular atuais, a eficácia desses procedimentos são negados se a mancha (s) não pode ser facilmente visualizado dentro da amostra de interesse em um ponto de tempo desejado. Essa limitação é problemático para os investigadores, especialmente quando se refere aos estágios embrionários iniciais da ontogenia peixe-zebra, o que poderia levar a lacunas em nossa compreensão de vários processos de desenvolvimento que surgem nestes momentos. Durante o desenvolvimento normal de peixe-zebra, o saco vitelino diminui progressivamente em tamanho com a idade do embrião 11. Portanto, nestas fases posteriores de desenvolvimento (> 24 horas após a fertilização), coloração desejo é bastante simples de analisar, porque o embrião é maior em comparação com o seu vizinho saco vitelino. No entanto, este não é o caso de a fase de botão de cauda somitogénese precoce (quando o embriãomassa está posicionada à volta da gema), onde o saco vitelino opaco pode, por vezes, obscurecer a visualização da mancha. Por conseguinte, o método de montagem plana foi concebido para ajudar a aliviar os problemas de imagem e análise de dados associados com a caracterização de amostras de embriões de peixes-zebra precoces (esquematizados na Figura 1 e Figura 2), e tem sido amplamente utilizada desde a fenotipagem sistemática de mutações genéticas isoladas a partir das primeiras telas genéticos grande escala 21.
Desde o advento das técnicas de montagem plana, a análise das fases iniciais de desenvolvimento foi significativamente melhorada. Uma vez que a gema é removido do embrião, é possível estabelecer o plano de embriões em uma lâmina de vidro com a orientação desejada para a imagiologia. Esta posição bidimensional permite a visualização de todo o embrião de uma só vez, o que elimina a necessidade de rodar a amostra. Vários tecidos estão localizados em amplos domínios de embrião, tais como oos precursores que formam o sangue e rim. Além disso, pode-se precisar de comparar vários tecidos em desenvolvimento diferentes ao mesmo tempo. Montagem plana permite ao pesquisador visualizar simultaneamente todo o domínio de tais grupos de células, e, portanto, pode ajudar muito quantificações como uma medição da área de um tecido ou de células conta. Esta técnica tem, em última análise ajudou a levar a muitas descobertas a respeito de uma variedade de mecanismos de desenvolvimento importantes subjacentes hematopoiese, neurogênese e organogénese. Assim, uma vez dominado, as aplicações para esta técnica simples para os pesquisadores são bastante consideráveis.
Por exemplo, em um estudo sobre a escolha linhagem durante hematopoiese, montagem plana preparações de embriões de peixes-zebra nas fases somito (SS) 14 e 18 foram utilizados para ilustrar as mudanças que ocorreram no padrão do fator de transcrição dedo PU.1 zinco entre a expressão de tipo selvagem e GATA1 morfolino embriões injectados 22.Este método permitiu a detecção de um domínio PU.1 expandida em 18 ss, indicando que GATA1 é mais provável que regula a expressão de PU.1 na massa celular intermediária (ICM) em torno deste ponto de tempo. Embriões plana adicionais montados coradas para diferentes genes eritróides incluindo gtpbp1 e epsin demonstraram uma perda na expressão destes genes mutantes que eram vlt GATA1 – / -. Outras análises mostraram qualquer alteração na expressão de genes, como erythoid biklf e testhymin que eram conhecidos como sendo independente da actividade gata. Portanto, em conjunto com os seus outros resultados experimentais, foi revelado que GATA1 é essencial na regulação da diferenciação de células dentro da linhagem mielo-eritróides. Em um estudo do desenvolvimento da crista neural, montagens planas foram usados para examinar a expressão Crestin em mont blanc (mob M610) mutantes em um estudoexaminar os papéis de mont blanc e função do gene tfap2a 23. Aos 10 e 20 ss, expressão Crestin foi totalmente revogada na cabeça e diminuiu na região do tronco de mutantes M610 mob em comparação com a expressão normal, do tipo selvagem, em última análise, ajudar este grupo a concluir sobre a importância da mont blanc e tfap2a regulação durante a formação da crista neural. Além disso, em termos de organogénese, montagens planas permitiram a descoberta da presença de domínios distintos no campo progenitora renal precoce durante o desenvolvimento do rim embrionário do peixe-zebra, conhecidos como os pronefros. O embrião do peixe-zebra fornece um sistema conservado e ainda anatomicamente simples para estudar como progenitoras renais dar origem a unidades de nefrónios funcionais que compreendem os pronefros, um processo conhecido como nefrogênese 6,7 (Figura 4). Análise de montagem plana tem sido útil para os domínios de documentos de reprogenitores nal e para dissecar o resultado de mudanças na sinalização RA durante pronefros padronização 6,7 (Figura 5), o que era até então desconhecida. Tomados em conjunto, estes exemplos sugerem que há de fato muitas amplas aplicações para esta montagem plana protocolo do estudo de diversos processos que ocorrem durante o desenvolvimento normal e estados doentes.
Conceitualmente, este procedimento plana de montagem é bastante simples em geral. No entanto, as manipulações e grau de finesse necessários para dominar este método pode ser bastante difícil de dominar, na ausência de demonstração visual. Portanto, este protocolo foi elaborado para permitir aos investigadores, especialmente aqueles que são novos para o modelo de peixe-zebra, com a oportunidade de entender melhor como executar esta técnica e partilhar o nosso aconselhamento sobre os reagentes que podem otimizar a manipulação de tecidos. Esperamos que este protocolo acabará por permitir que outros na comunidade para refinar as condições da amostra mais ideal para ser used para geração de imagens premium, análise de dados e comunicação dos seus resultados em publicações. Em última análise, isso deve permitir aos investigadores para superar os obstáculos anatômicos do peixe-zebra durante a embriogênese precoce, o que pode obscurecer a apresentação de resultados experimentais, e resolver estes através do uso desta técnica simples, mas significativo.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi parcialmente financiado através do financiamento para a RAW a partir de cada um dos seguintes: NIH concede K01 DK083512, DP2 OD008470 e R01 DK100237; March of Dimes Basil O'Connor Iniciado Scholar concessão de uma subvenção n º 5-FY12-75; arranque fundos da Universidade de Notre Dame Faculdade de Ciências e Departamento de Ciências Biológicas. Gostaríamos especialmente de agradecer Elizabeth e Michael Gallagher, junto com toda a família Gallagher, que concedeu uma generosa doação para a Universidade de Notre Dame para promover investigação em células estaminais. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Agradecemos aos funcionários do Departamento de Ciências Biológicas, pelo seu apoio, e do Centro de Pesquisa em Zebrafish Notre Dame para a sua notável dedicação no cuidado e bem-estar de nossa colônia de peixe-zebra. Finalmente, agradecemos aos membros de nosso laboratório de pesquisa para seus comentários, discussões e idéias sobre este trabalho, comobem como Marigold (Maripooka) e Zinnia Wingert para fornecer naturalmente derramou bigodes felinos para fazer ferramentas chicote mais excelentes para a nossa pesquisa.
Materials
| 50 X E3 | 250 mM NaCl, 8.5 mM KCL, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination. | ||
| 1 X E3 | Dilute 50 X E3 in distilled water. | ||
| mesh tea strainer | English Tea Store | SKU #ASTR_KEN, MPN#1705 | |
| embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
| transfer pipet | Samco | 202, 204 | |
| flat-bottom microcentrifuge tube | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
| glass vial | Wheaton | 225012 | |
| 1 X Pbst | 0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs, made by diluting 10 X Pbs in distilled water. | ||
| Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | |
| 10X Pbs | American Bioanalytical | AB11072 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 19210 | |
| 4% PFA/1X Pbs | Dissolve 4% PFA (w/v) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze aliquots for storage at -20 °C. Thaw just before use and do not refreeze stocks. | ||
| filter sterilization unit | Corning | 430516 | 1L filter system, 0.45 um CA |
| MeOH | Sigma | 34860-4L | |
| proteinase K | Roche | 03-115-879-001 | Dissolve in distilled water to make proteinase K stock (10 mg/mL) and store aliquots at -20 °C. |
| HYB+ | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 ug/ul heparin | ||
| DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents | Roche | 11175025910; 11685619910 | Refer to manufacturer instructions. |
| SP6 RNA polymerase | Roche | 11487671001 | |
| T7 RNA polymerase | Roche | 10881775001 | |
| T3 RNA polymerase | Roche | 11031171001 | |
| RNase 1 inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| DNase 1 inhibitor, 10 X DNase 1buffer | Roche | 4716728001 | |
| glycogen | Roche | 10901393001 | |
| Ethanol (EtOH) | Sigma | E7023 | Aliquot 50 ml aliquots of 100% EtOH and 70% EtOH (diluted with molecular grade water) and store at -20 °C. |
| molecular grade distilled water | Mediatech | 25-055-CM | |
| waterbath | Thermo | 51221073 | Model 2831 |
| nanodrop | Thermo | ND-2000c | |
| formamide | American Bioanalytical | AB00600 | Store at -20 °C. |
| 20X SSC | American Bioanalytical | AB13156 | |
| MAB | 2L formula: Into 1.5 L of distilled water, mix 23.2 g maleic acid, 17.5 g NaCl, 55.0 g Trisma base, then add 8 mLs of 1M Tris-HCl pH 9.5, and then fill to 2 L. Autoclave. | ||
| MABT | MAB + 0.1% Tween-20 | ||
| block solution | We make in 50 ml fresh aliquots: 10 mLs of BSA (from 10% lab stock), 5 mls of FCS (from stock), and 35 mLs of MABT. Save unused block at 4 °C to use for antibody solution. Note: Thaw the BSA and FCS stocks at 37 °C—if you thaw at a higher temperature they become a thick gel (do not use). | ||
| FCS (fetal calf serum) stock | Invitrogen | 16140089 | Aliquot in 5 or 10 ml portions and store at -20 °C. |
| BSA (bovine serum albumin) stock | American Bioanalytical | AB00448 | Make a 10% stock diluted in MAB by dissolving the BSA flakes at room temperature with rapid stirring, then store 10 ml aliquots at -20 °C. Store undissolved BSA flakes at 4 °C. |
| anti-digoxigenin antibody | Roche | 11-093-274-910 | Store at 4 °C. |
| anti-fluorescein antibody | Roche | 11-426-338-910 | Store at 4 °C. |
| 12-well staining dish | BD-Falcon | 35-3225 | |
| pre-staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20. Always make fresh: it will precipitate in the course of a few days. | ||
| staining solution-purple | For every 10mLs needed: add 45 uL of NBT and 35 uL of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples). | ||
| staining solution-red | For every 10mLs needed: add 31.5 uL of INT and 35 uL of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).. | ||
| NBT stock | Sigma | N6876 | Stored at -20 °C; powder diluted 50mg/mL in 70% DMF, 30% water. |
| INT stock | Sigma | I8377 | Stored at -20 °C; powder diluted 55mg/mL in 70% DMF, 35% water. |
| BCIP stock | Sigma | B8503 | Stored at -20 °C; powder diluted 50mg/mL in 100% DMF. |
| DMF (dimethylformaldehyde) | American Bioanalytical | AB00450 | |
| glycine | Sigma | G8898 | 0.1 M glycine, pH 2.2 |
| small plastic Petri dish | Corning | 430589, 430588 | |
| glycerol | Sigma | G7893 | |
| fine forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
| lash tool | Constructed by affixing a suitable lash to a pipet tip (sizes ranging from P10-P1000 can be used) using superglue. We use a naturally shed human eyelash, a naturally shed animal whisker or wiry fur coat hair, or a natural or synthetic lash purchased from the beauty department at a pharmaceutical or retail store (extra long lashes are most amenable to stable mounting on the pipet tip). The pipet tip is affixed onto a straight rod (8-10 cm in length) such as a needle holder (e.g. Fisher 08-965-A) for easy handling. See Figure 3 for images of these homemade tools. | ||
| glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | White Frost |
| glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
| modeling clay | Hasbro | Playdoh | Other craft modeling clay products can be substituted |
| slide holder | Thermo-Fisher | 12-587-10 | Cardboard tray to store slides flat |
| stereomicroscope | Nikon | SMZ645, SMZ1000 | |
| compound microscope | Nikon | 80i, 90i |
References
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