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免疫与感染

El uso de<em> Flexneri Shigella</em> Para estudiar las interacciones Autophagy Citoesqueleto

Published: September 09, 2014
doi:
10.3791/51601
, ,
1Section of Microbiology, MRC Centre for Molecular Bacteriology and Infection,Imperial College London, 2Département de Biologie du Développement et des Cellules Souches,Institut Pasteur, Unité Macrophages et Développement de l’Immunité

Summary

Para contrarrestar la diseminación de patógenos, células huésped reorganizar su citoesqueleto de compartimentar bacterias e inducir la autofagia. Uso de la infección por Shigella de las células de cultivo de tejidos, de acogida y determinantes de patógenos subyacentes este proceso se identifican y se caracteriza. El uso de modelos de pez cebra de la infección por Shigella, el papel de las moléculas y mecanismos descubiertos son investigados in vivo.

Abstract

Flexneri Shigella es un patógeno intracelular que puede escapar de los fagosomas para alcanzar el citosol, y polimerizar el anfitrión actina del citoesqueleto para promover su motilidad y difusión. El nuevo trabajo ha demostrado que las proteínas implicadas en la motilidad actina basada también están vinculados a la autofagia, un proceso de degradación intracelular crucial para la inmunidad celular autónoma. Sorprendentemente, las células huésped pueden impedir la movilidad basada en la actina de S. flexneri por compartimentar bacterias dentro de 'jaulas septina' y la orientación a la autofagia. Estas observaciones indican que una comprensión más completa de septins, una familia de proteínas de unión a GTP filamentosos, proporcionará nuevos conocimientos sobre el proceso de autofagia. Este informe describe los protocolos para monitorear las interacciones autofagia-citoesqueleto causadas por S. flexneri in vitro utilizando células de cultivo de tejidos e in vivo utilizando larvas de pez cebra. Estos protocolos permiten la investigación de mechanis intracelularesms que controlan diseminación bacteriana a nivel de organismo molecular, celular, y todo.

Introduction

Shigella flexneri, una bacteria enteropatógena invasiva Gram-negativa, puede escapar de los fagosomas al citosol, y polimerizar el citoesqueleto de actina de acogida para evadir la respuesta inmune citosólicas y promover intra e intercelular movimiento 1,2. A pesar de la comprensión de la motilidad basado en actina in vitro 3,4, los mecanismos que restringen la diseminación bacteriana in vivo no han sido completamente definido. Esto es crítico para una comprensión más completa de la inmunidad innata y la defensa del huésped.

Septinas, una familia de proteínas altamente conservadas entre los metazoos, son guanosina trifosfato (GTP) -vinculante proteínas que se ensamblan en complejos hetero-oligoméricos y forman filamentos polares que se asocian con las membranas celulares y el citoesqueleto de 5,6. Trabajos recientes han descubierto que las células huésped infectadas pueden impedir la motilidad basado Shigella actina por bacterias compartimentar dirigidos a autophAgy dentro "jaulas septina ', revelando el primer mecanismo celular que contrarresta la motilidad basado actina 7,8. Un campo abierto de investigación se encuentra ahora en la "biología septina y la infección". Asamblea Septina, inducida por una variedad de agentes patógenos (por ejemplo, Listeria monocytogenes 7,9,10, Mycobacterium marinum 7,8, Candida albicans 11), puede surgir como un tema clave en la defensa del huésped 5,12.

La autofagia, un proceso de degradación intracelular altamente conservada, es visto como un componente clave de la inmunidad de células autónomas debido a su capacidad para ofrecer bacterias citosólicas al lisosoma 13,14. Sin embargo, el papel de la autofagia bacteriana in vivo para restringir o promover la replicación bacteriana sigue siendo poco entendido 15,16. El pez cebra (Danio rerio) ha surgido como un modelo para el estudio de los vertebrados de infecciones debido a que es accesible ópticamenteen las etapas larvales cuando el sistema inmune innato ya es funcional 17,18. Trabajos recientes han caracterizado a la susceptibilidad de las larvas de pez cebra para S. flexneri, un paradigma para la autofagia bacteriana 15, y se ha utilizado el modelo de infección -zebrafish Shigella a estudiar la manipulación de la autofagia para la terapia antibacteriana in vivo 19.

Este informe proporciona nuevas herramientas y ensayos para estudiar S. interacciones flexneri con la autofagia y el citoesqueleto. En una primera etapa, los protocolos para monitorear las interacciones autofagia citoesqueleto se describen utilizando la infección por Shigella de la línea celular epitelial humana HeLa. Para evaluar el papel de las interacciones autofagia-citoesqueleto en el proceso de infección por Shigella in vitro, los métodos para manipular la autofagia y componentes del citoesqueleto (utilizando siRNA o reactivos farmacológicos) se proporcionan. El nuevo trabajo ha demostrado que mediante el uso de Shigella infección olarvas de pez cebra f, ensayos similares se puede aplicar para estudiar la biología de las células de la infección in vivo. Protocolos para preparar e infectan larvas de pez cebra se detallan, y para evaluar la respuesta del huésped a la infección por Shigella en vivo, los protocolos para determinar la supervivencia de acogida y la carga bacteriana de larvas infectadas se proporcionan. Métodos para controlar el reclutamiento de marcadores septinas y autofagia a Shigella (utilizando larvas de pez cebra fija o vivir) y los métodos para probar el papel de estos procesos in vivo [usando oligonucleótidos de morfolino (inyectadas en embriones en estadio de 1-4 células) o reactivos farmacológicos ( se añade directamente al agua del baño de pez cebra)] también se discuten. Se espera que este programa de trabajo para proporcionar una visión de los mecanismos necesarios para el control de la infección por las respuestas de acogida citosólicas.

Protocol

1. Monitoreo autofagia y el citoesqueleto in vitro utilizando células de tejido Cultura Preparar S. flexneri Placa S. flexneri M90T (de tipo salvaje) de -80 ° C en glicerol en un Rojo Congo caseína de soja tríptico (TCS) placa de agar. Incubar toda la noche a 37 ° C. La misma placa se puede utilizar para varios experimentos. Escoja una colonia individual y crecer en 8 ml de medio de TCS en un agitador durante la noche a 37 ° C. NOTA: unión Congo-rojo indica que el plásmido de virulencia se ha mantenido. Para subcultura bacterias de crecimiento exponencial, inocular TCS fresco con el cultivo bacteriano durante la noche a 1/80 de dilución y crecer en un agitador a 37 ° C a OD 600 = 0,3-0,6. Gira la subcultura bacteriana a 1.000 xg durante 5 min. Lavar el sedimento con MEM y se centrifuga a 1000 xg durante 5 min. Reconstituir el precipitado en MEM a OD 600 = 0,3-0,6. Preparar HeLa CeLLS para la infección Se cultivan las células HeLa en "medio completo", es decir., MEM más L-alanil-L-glutamina suplementado con piruvato de sodio 1 mM, solución de aminoácidos no esenciales 0,1 mM, y 10% de suero de ternera fetal. Placa 1-1,5 x 10 5 células en placas de 6 pocillos 24 o 48 horas antes de comenzar el experimento. Placa en cubreobjetos de vidrio en placas de 6 pocillos para microscopia, o placa en placas de 35 mm de fondo de vidrio para prepararse para imágenes en vivo. NOTA: (por ejemplo., Colas de actina, jaulas septina) para seguir la autofagia (por ejemplo, Atg8 / LC3 + ve autofagosomas) y citoesqueleto dinámica en tiempo real, durante la infección por Shigella utilizando imágenes en vivo, las células de cultivo de tejidos pueden ser transfectadas transitoriamente utilizando las buenas prácticas agrarias, RFP- o construcciones CFP-etiquetadas (ver Discusión). Infección Infectar las células con 100: 1 multiplicidad de infección (MOI) de Shigella (OD 600 = desde 0,3 hasta 0,6) diluido en MEM; añadir directamente a las células HeLa chapados en 6-wplacas ell 24 – 48 h antes de la infección (como se describe en la sección 1.2) en 2 ml de MEM (suero de hambre). Para maximizar la adherencia bacteriana a las células huésped, bacterias y células de centrifugación a 700 xg durante 10 min a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, se incuba durante 30 min a 37 ° C, 5% de CO 2 y permitir la infección de proceder. Lavar las células dos veces con MEM infectadas fresco y se incuba con gentamicina que contienen medio completo (50 g / ml, para eliminar las bacterias extracelulares) durante 1-4 hr dependiendo del experimento. Fijación y Etiquetado de las células HeLa infectadas para Microscopía Lavar las células infectadas dos veces con PBS 1x, y fijar durante 15 minutos en 4% de paraformaldehído en PBS 1x a temperatura ambiente. Para quitar paraformaldehído, células de lavado 2 veces con 1 × PBS. Se incuban las células fijas en cloruro de amonio 50 mM durante 10 min a temperatura ambiente. Lavar una vez con PBS 1x, y permeabilizar las células durante 4 minutos con 0,1% de condensados ​​de óxido de etileno octilfenol en la sala de temperatura. NOTA: Alternativas a Octilfenol condensado de óxido de etileno para la permeabilización, tales como saponina o metanol, se pueden aplicar para diferentes preservación de las estructuras celulares 20. Lavar las células en 1x PBS y se incuban en cámara húmeda con anticuerpos primarios contra los componentes críticos autofagia (por ejemplo, p62 / SQSTM1) o el citoesqueleto de septinas (sept2, SEPT6, SEPT7, SEPT9, y sept11 se expresan en células HeLa) durante 30 min (a temperatura ambiente) a la noche (a 4 ° C). Lavar las células dos veces con 1x PBS y se incuban en cámara húmeda con anticuerpos secundarios, y la etiqueta de actina filamentosa (F-actina) con faloidina, durante 30 minutos (a temperatura ambiente) para durante la noche (a 4 ° C). Para la tinción de los núcleos celulares de acogida añaden 4 ", 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Lavar las células en PBS 1x y montar los cubreobjetos de vidrio en las diapositivas utilizando medio de montaje. Imágenes microscópicas de las células HeLa infectadas Para la imagen de la infejadas células utilizan un microscopio confocal de epifluorescencia o un objetivo de 63X y 100X para identificar o marcado con DAPI Shigella. NOTA: Como se muestra en las figuras 1A – 1C, jaulas septina se pueden visualizar como anillo como las estructuras, ~ 0,6 m de diámetro, que rodea las bacterias citosólicas polimerización de la actina y la contratación de los marcadores de autofagia (por ejemplo, p62 y LC3) 7,8. Por el contrario, las bacterias polimerización colas de actina no serán compartimentados por jaulas septina y no serán dirigidos a la autofagia 7,8. El uso de un microscopio confocal de epifluorescencia o un objetivo de 63X y 100X o, cuantificar el número de bacterias intracelulares por campo microscópico. También cuantificar el número de bacterias atrapadas en jaulas septina y específicas para la autofagia, o polimerización colas de actina y que escapan autofagia. Para determinar el porcentaje de bacterias atrapadas en jaulas septina o polimerización colas de actina, tomar una serie de imágenes Z-pila de infected células, el proceso de las imágenes y contar al menos 500-1.000 bacterias por experimento de al menos 3 experimentos independientes. 2. Análisis Funcional de autofagia y el citoesqueleto In Vitro NOTA: Tanto la genética y enfoques farmacológicos pueden ser utilizados para perturbar la autofagia en las células de cultivo de tejidos infectados, y el impacto de estos tratamientos en el curso de la infección puede ser monitoreado. siRNA mediada por silenciamiento Placa 0,8 x 10 5 células HeLa en cubreobjetos de vidrio en placas de 6 pocillos en medio completo. Transfectar el día siguiente utilizando un reactivo de transfección a base de lípidos con siRNA contra la autofagia y / o marcadores del citoesqueleto. Después del período de incubación, infectar a las células con Shigella como se describe en la sección 1.3. Fijar y marcar las células como se describe en la sección 1.4. La manipulación farmacológica <br /> NOTA: El citoesqueleto se puede manipular farmacológicamente, por ejemplo, para despolimerizar el uso citoesqueleto de actina citocalasina D o latrunculin B, para despolimerizar los microtúbulos nocodazol utilizan, para bloquear la actividad de actomiosina uso blebbistatin, o para interrumpir septinas uso conjunto de forchlorfeneuron. La autofagia puede ser estimulado mediante el uso de rapamicina o bloqueado por el uso de bafilomicina. Para manipular el citoesqueleto durante la infección por Shigella, primero infectar las células con Shigella como se describe en la sección 1.3 y dar tiempo suficiente para que las bacterias entran en las células y se escapan del fagosoma al citosol (por ejemplo.,> 1,5 infección post hr). Diluir los medicamentos de la solución madre [solución madre suspendidas en dimetilsulfóxido (DMSO)] en el MEM a una concentración final de 5 M (citocalasina D, latrunculin B, nocodazol), 20 M (forchlorfeneuron) o 50 M (blebbistatin), y tratar las células 30 minutos a 37 ° C. La cantidad total de fármaco (volumen del DMSO / dmezcla de alfombra) añadió por placa / vial de células es 5.1 l (dependiendo de la solución madre) por 2 ml de medio. Tratar las células con una dosis similar de DMSO diluido en MEM como un control negativo. Fijar y marcar las células como se describe en la sección 1.4. NOTA: Para la manipulación del flujo de autofagia (en las células infectadas o no infectadas), se extienden de tratamiento de drogas utilizando la rapamicina (20 nM) o bafilomicina (160 nM) de 4 a 12 hr. Western Blot NOTA: autofágicas actividad puede cuantificarse midiendo el nivel de proteína de marcadores autofagia tales como p62 y LC3. Después del período deseado de incubación, recoger y lisar las células para inmunotransferencia. Extractos de proteínas se ejecutan en 8, 10 o 14% de acrilamida geles. Flujo de autofagia, es decir. la tasa de la autofagia, se puede analizar como se describe en 21,22. Imagen microscópica y Cuantificación El uso de un microscopio confocal de epifluorescencia o un objeto de 100X y 63X oive, el efecto de siRNA o tratamiento farmacológico en la infección por Shigella puede ser evaluada por microscopía cuantitativa (es decir, contando de autofagosomas, jaulas septina y colas de actina) como se describe en la sección 1.5 y se muestra en las figuras 2A y 2B. 3. imágenes in vivo de S. flexneri Interacciones con autofagia y el citoesqueleto NOTA: El modelo de pez cebra de la infección por Shigella se puede utilizar para investigar las jaulas septina y autofagia in vivo 19. Preparar S. flexneri Cultura S. flexneri como se describe en la sección 1.1. En OD 600 = 0,3-0,6, vuelta 8 ml subcultivo bacteriano a 1000 xg durante 10 min. Lavar el sedimento con 1x PBS y centrifugar a 1000 xg durante 10 min. Resuspender el precipitado en 80 l de 0,1% de fenol rojo 1x PBS para obtener ~ 2000 bacterias / nl. Mantenga la bactpreparación erial en el hielo para reducir la velocidad de crecimiento. NOTA: La adición de fenol rojo le ayudará a visualizar el inóculo al inyectar en las larvas. Preparar pez cebra larvas para inyección NOTA: El pez cebra se establecen como los huevos y se identifican como los embriones después de la fertilización hasta 72 horas, cuando se les llama larvas. Raza adultos de pez cebra como se describe en Westerfield 23 mediante la colocación de 4 hombres y 8 mujeres (por lo general una proporción de 2: 1) en una pecera independiente con el fondo cubierto de canicas (que evitará que los adultos coman los huevos desovados). Como alternativa, colocar cestos de recolección de huevos dentro de los tanques de cría de la noche anterior. NOTA: Los huevos son fecundados ~ 30 minutos después de las luces se encienden en las instalaciones de pez cebra 23, y deben recogerse lo antes posible para evitar el crecimiento de moho. Cestas de recolección de huevos sirven para recoger los huevos para que puedan ser cosechadas fácilmente y también proteger los huevos de los adultos. Recoger el embrións y les limpiar por lavado en medios embrión (E2) con 0,003% de lejía durante 10 min. Retire E2 con lejía, lavar los embriones 5x en un medio de E2, y hacer crecer los embriones en 10 cm placa de Petri (100 embriones / 50 ml de medio E2) a 28 ° C. Si se utilizan los embriones o larvas para estudios de microscopía, a después de la fecundación 24 hr añadir 0.003% N-feniltiourea al medio de E2 para evitar melanización. Mantener los embriones a los 28 º C para el desarrollo normal. NOTA: las larvas de pez cebra son listas para la infección después de la fecundación en 72 horas. Para los procedimientos de infección y de microscopía, anestesiar larvas de pez cebra en 200 g / ml tricaína en E2. Preparación de pez cebra para larvas intravenosa y la infección local NOTA: Para evaluar la supervivencia del pez cebra durante la infección por Shigella, realizar inyecciones intravenosas caudales. Para visualizar el reclutamiento de marcadores septina y autofagia a Shigella, realice una infección en zonas localizadas como el músculo de la cola. Para una inyección intravenosa caudal, la posición de las larvas anestesiadas lateralmente con el lado dorsal hacia la aguja. Como se muestra en la Figura 3A, coloque la punta de la aguja cerca (posterior) a la abertura urogenital, con el objetivo de la vena caudal, y perforar la piel y suministrar la dosis deseada bacteriana (volumen de inyección 1-5 nl). NOTA: la infección por vía intravenosa es difícil de realizar y tomará varias semanas de entrenamiento para sentirse cómodo con este procedimiento. La inyección de rojo fenol (sin bacterias) para la formación ayudará a evaluar el lugar de la inyección correctamente. NOTA: En el caso de Shigella, dependiente de la dosis experimentos han demostrado que una infección de dosis baja (<1.000 CFU) se borra dentro de 48 h, y una infección de dosis alta (> 4.000 CFU) conduce a la sede de la mortalidad dentro de 48 hr 19. Para una infección del músculo de la cola, colocar las larvas anestesiados como se describe en la sección 3.3.1. Como se muestra en la Figura 3A, coloque el cuidado de la agujaa durante somitas musculares (es decir, segmentos de músculo esquelético) e inyectar un volumen pequeño (es decir., 1 nl) de preparación bacteriana. Inyección intravenosa de bacterias en larvas Tire microcapilares vidrio borosilicato como se describe en el 24. Conectar la aguja al soporte del manipulador manual de grueso tridimensional y romper la punta de la aguja con unas pinzas finas. Para cargar la aguja, coloque una gota de cultivo bacteriano en un cubreobjetos. Encender el cilindro microinyector y gas, ligeramente sumergir la punta de la aguja dentro de la gota, y llenar la aguja con la cantidad deseada de preparación bacteriana. Para calibrar el volumen de inyección, coloque una gota de aceite mineral en una hoja de la cubierta e inyectar la preparación bacteriana. Medir el diámetro de la gota utilizando un micrómetro y calcular el volumen inyectado [V = (4/3) πr 3]. NOTA: El uso de la configuración de inyección de 40 psi y 50 ms con una bacteripreparación al que se describe en la sección 3.1 se dan ~ 2000 UFC / nl. Preparar la placa de inyección utilizando un molde de plástico como se describe en Westerfield 23. Transferir las larvas a la placa de inyección y alinearlos usando un pincel fino. Orient e inyectar las larvas como se describe en la sección 3.3.1. Para la evaluación de la supervivencia de pez cebra, las larvas infectadas transferencia individualmente en placas de 24 pocillos en 1 ml de E2 / pocillo y se incuba a 28 ° C. Monitorear las larvas infectadas al día durante los próximos 2-5 días y la supervivencia parcela con el tiempo (Figura 3B). Plating pez cebra larvas para la cuantificación bacteriana NOTA: Trabaje bajo una campana estéril para evitar la contaminación. Para evaluar el número de bacterias inyectadas en el pescado (después de la infección 0 hr tiempo) y para la cuantificación bacteriana en los puntos de tiempo deseados, sacrificar larvas de pez cebra con una sobredosis de tricaína (200-500 mg / L). Coloque larvas individuales en 1,5 ml poltubo de microcentrífuga ypropylene con 200 l de 0,1% de condensados ​​de óxido de etileno octilfenol 1x PBS y homogeneizar mecánicamente usando una mano de mortero. NOTA: Para confirmar la carga bacteriana en el volumen de inyección, la bomba de una dosis igual en una gota 1x PBS estéril y la placa hacia fuera. Hacer una dilución en serie de los homogeneizados de larvas de pez cebra en agua estéril y placa en caldo de lysogeny (LB) placas de agar. Las larvas pueden ser plateado alternativamente en placas de Rojo Congo TCS para discriminar entre Shigella haber mantenido el plásmido virulento o no. NOTA: La placa 3 o más peces no infectado como control para comprobar el estado de las larvas de pez cebra se utiliza para la infección. Después de la incubación durante la noche de las placas a 37 ° C, contar las colonias bacterianas. Como se muestra en la Figura 3C, representar usando una escala logarítmica. NOTA: La carga bacteriana durante la infección de larvas de pez cebra también se puede visualizar utilizando la etiqueta fluorescente Shigella y yo microscópicaMaging como se describe en la sección 3.7 o 3.8 (Figura 3D). El pez cebra larvas Inmunoticción En los puntos de tiempo deseados, sacrificar las larvas mediante una sobredosis de tricaína. Recoger el pescado en 1,5 ml tubos de microcentrífuga de polipropileno (de 10 a 20 larvas / tubo). Fijar las larvas utilizando paraformaldehído al 4% con 0,4% de condensado de óxido de etileno octilfenol en 1x PBS y se incuban en un agitador orbital (para evitar la agrupación de las larvas) durante 2 horas (a temperatura ambiente) o durante la noche (a 4 ° C). NOTA: La microscopía electrónica se puede utilizar para análisis ultraestructurales de larvas de pez cebra infectada. En este caso, los embriones anestesiados deben ser fijados y procesados ​​de acuerdo con Mostowy et al 19. Lavar 3x en PBS 1x 0,4% condensado de óxido de etileno octilfenol durante 5 min, entonces el bloque en solución de bloqueo (10% de suero bovino fetal, 1% de DMSO, 0,1% de monolaurato de polioxietilensorbitán en 1x PBS) durante 1 hora a temperatura ambiente. Dilaúd el anticuerpo primario en solución de bloqueo. Añadir larvas al anticuerpo primario diluido e incubar durante la noche a 4 ° C en un agitador orbital. Utilice anticuerpos primarios como se describe anteriormente en la sección 1.4.3. Lavar las larvas 4x durante 15 min en 0,1% de monolaurato de polioxietilensorbitán 1x PBS a temperatura ambiente. Diluir el anticuerpo secundario en solución de bloqueo. Añadir larvas al anticuerpo secundario diluido e incubar durante la noche a 4 ° C en un agitador orbital. Utilice los mismos anticuerpos secundarios y faloidina como se describe en la sección 1.4.4. Se lava 4x para 15 min en 0,1% de monolaurato de polioxietilensorbitán 1x PBS a temperatura ambiente. Para la tinción de núcleos de células anfitrionas añadir DAPI (150 nM concentración final) durante el primero de estos 15 min lavados. Para la conservación de las larvas de marcado con fluorescencia, incubar progresivamente en un gradiente de glicerol de 15, 30, 60, y 80% diluido en PBS 1x y 0,1% de monolaurato de polioxietilensorbitán durante 2 horas (en el temperado habitacióntura) para durante la noche (a 4 ° C). NOTA: Stained larvas se puede almacenar durante largos períodos de tiempo en 80% de glicerol a 4 ° C (por ejemplo, 4 meses.). Imagen microscópica de fijo pez cebra larvas Transferencia de las larvas incrustado glicerol fijado a una pequeña gota de 80% de glicerol en una placa de Petri de 35 mm (para microscopía estereoscópica) o un plato de fondo de cristal completa (por miscopy confocal). Tome Z-pila serie de imágenes de las larvas infectadas y procesar las imágenes según sea necesario. Utilice un epifluorescencia o un microscopio confocal y un objetivo de 10X o 20X para la imagen de todo el organismo. A continuación, utilice un microscopio confocal y un objetivo de 40X, 63X o 100X para visualizar las células individuales y la contratación de la autofagia y el citoesqueleto marcadores a bacterias individuales en vivo 19 (Figuras 4A y 4B). NOTA: Infect peces en el músculo de la cola y de montaje en glicerol plana a lo largo de la parte inferior del plato de fondo de vidrio para permitir eaenfoque sy. Vive microscópico de imágenes de Infected pez cebra larvas NOTA: Las larvas son ópticamente accesible, por lo tanto en autofagosomas in vivo pueden ser visualizados usando la línea transgénica pez cebra-GFP Lc3 25. Infectar larvas de pez cebra como se describe en la sección 3.3 y el monte como se describe en esta sección. Preparar bajo punto de fusión al 1% de agarosa (LMA) en E2 y dejar enfriar a 35-37 ° C para evitar daños larvas / asesinato. Distribuir gotas de LMA en una placa de Petri de 35 mm (para microscopía estereoscópica) o un plato con fondo de cristal completa (por microscopía confocal). Transferencia anestesiado larvas de pez cebra individualmente (con tan poca agua como sea posible) a la LMA gotas. Larvas de Oriente a la posición deseada usando un pincel y esperar a que la agarosa se solidifique. Cubra toda la superficie del plato con LMA, y superposición con E2 que contiene 200 mg / ml tricaína para evitar la preparación de la desecación y que los peces puedan intercambiar oxígeno del agua. Utilice un epifluorescencia o un microscopio confocal y un objetivo de 10X o 20X para obtener imágenes de todo el larvas de pez cebra. Utilice un microscopio confocal y un objetivo de 40X, 63X o 100X para visualizar authopagosomes bacterianas (por ejemplo, las buenas prácticas agrarias-Lc3 + ve vacuolas rodean Shigella) in vivo. Tome un Z-pila de larvas infectadas con el tiempo (por ejemplo., Cada 2 minutos durante varias horas) para visualizar autofagosomas, y su dinámica, en tiempo real. 4. Análisis Funcional de autofagia y el citoesqueleto en Vivo NOTA: El impacto de las perturbaciones farmacológicos y genéticos de la autofagia en el curso de la infección pueden ser monitoreados a nivel de todo el animal, y en el nivel de la célula individual. La autofagia Manipulación por Morpholino Inyección Reconstituir morfolino oligonucleótidos en agua estéril a una solución madre de 1 mM por calentamiento a 65 ° C durante 10 min. Tiendaa temperatura ambiente. NOTA: morfolino inyecciones de oligonucleótidos deben ser realizados en 1-4 embriones en estadio de célula. Preparar la solución de trabajo oligonucleótido morfolino estéril con 0,1% de rojo de fenol en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco. Cargue la aguja como se indica en el apartado 3.4.2., Morfolino volumen de inyección de oligonucleótido puede ser calibrado como se describe en el apartado 3.4.3. NOTA: El fenol rojo le ayudará a visualizar el volumen inyectado. Prepare una cámara embrión-posicionamiento (es decir., Un portaobjetos de microscopio pegado con cianoacrilato en una placa de Petri de 10 cm con tapa bordes enfrentados la aguja elimina parcialmente). Transferencia de embriones en estadio de 1-4 células a la cámara con una pequeña cantidad de agua y alinearlos con un pincel fino. Penetrar en el corion y la yema de huevo sin problemas. Una vez dentro, pulse el pedal para inyectar el volumen deseado de solución de oligonucleótido morfolino. NOTA: minimizar el volumen de inyección de 0,5 a 2 nl; volúmenes superiores than 5 nl pueden causar defectos en el desarrollo y aumentar la mortalidad de huevos. Después de la microinyección, los embriones limpios (por blanqueo tal como se describe en la sección 3.2) e incubar en una placa de Petri con E2 a 28 ° C. Infectar a las 72 horas de control después de la fertilización (es decir, las larvas de pez cebra inyectados con oligonucleótido morfolino control) o morphants p62 (es decir., Larvas de pez cebra inyectados con oligonucleótido morfolino p62) con Shigella como se describe en la sección 3.4. Evaluar la supervivencia y la carga bacteriana en los próximos 2-5 días como se describe en el apartado 3.5. Imagen fija larvas de pez cebra como se describe en la sección 3.7 y se destaca en la figura 4C, o viva imagen larvas de pez cebra como se describe en la sección 3.8. NOTA: La dosis efectiva oligonucleótido morfolino puede evaluarse en función de su eficacia para inhibir la transcripción de empalme o la traducción de proteínas (ver Discusión).

Representative Results

Tras la infección de las células de cultivo de tejidos in vitro, S. flexneri puede escapar del fagosoma e invadir el citosol. En el citosol, las células huésped pueden prevenir la basada en la motilidad-actina de Shigella por compartimentar las bacterias dentro de jaulas de septinas (Figura 1A). Las bacterias atrapadas por jaulas septinas también pueden marcarse mediante marcadores de autofagia p62 (Figura 1B) y LC3 (Figura 1C). Estas observaciones ponen de manifiesto un nuevo mecanismo de defensa del huésped que limita la difusión de patógenos invasivos, y también revelan nuevos vínculos entre la autofagia y el citoesqueleto. Sorprendentemente, el agotamiento de los marcadores de autofagia reduce significativamente septinas jaulas de bacterias (Figura 2A), y el trabajo también ha demostrado que el agotamiento de las jaulas de septinas reduce significativamente el reclutamiento de los marcadores de autofagia 8. Así, al menos en el caso de Shigella, septina conjunto de jaula y formatio autofagosoman puede ser visto como procesos interdependientes. Otros requisitos celulares para la compartimentación de Shigella por jaulas septinas incluyen polimerización de la actina y la actividad de actomiosina (Figura 2B). No existe un modelo natural de ratón de la shigelosis, y la investigación de la patogénesis de Shigella, la biología y la autofagia septina bacteriana in vivo se pueden beneficiar de un nuevo modelo animal de la infección, las larvas de pez cebra 19. Es posible infectar larvas de pez cebra mediante la inyección de bacterias en diversos sitios anatómicos tales como inyecciones intravenosas caudales para los experimentos de supervivencia, y las inyecciones musculares de la cola para la microscopía in vivo (Figura 3A). Dependiendo de la dosis, S. flexneri inyecta en larvas de pez cebra puede o bien ser eliminado dentro de 48 horas después de la infección, o puede dar lugar a una infección progresiva y finalmente fatal (Figuras 3B – 3D). Shigella virulencia factors se expresan a 28 ° C, la temperatura óptima de crecimiento del pez cebra, pez cebra y la infección por Shigella es estrictamente dependiente de su sistema de secreción de tipo III (T3SS) 19, un determinante de virulencia esencial en la enfermedad humana. Tomado en conjunto, estas observaciones indican que la larva de pez cebra representa un nuevo huésped valiosa para el análisis in vivo de la infección por Shigella. La accesibilidad óptica de las larvas de pez cebra permite la visualización de las jaulas septina vivo (Figura 4A) en, un logro que nunca antes se había logrado mediante modelos huésped de mamífero. Para complementar la evidencia de que las jaulas septina atrapan bacterias específicas para la autofagia en vivo, se puede infectar larvas de pez cebra transgénico que expresa GFP-Lc3 y observar contratación marcador de autofagia de Shigella (Figura 4B). Para el análisis de ultrastrucutral autofagosomas Shigella in vivo, elmicroscopía ECTRON se puede utilizar para mostrar claramente el secuestro citosólica de bacterias por vacuolas dobles de membrana 19. La autofagia es vista como un componente clave de la inmunidad de células autónomas y un mecanismo de defensa crucial contra bacterias intracytosolic 14-16. Para caracterizar la función de la autofagia in vivo, p62 larvas de pez cebra morfolino-tratada puede ser utilizado. A diferencia de la maquinaria autofagia núcleo [por ejemplo., Las 36 proteínas relacionadas con la autofagia (ATG) 26], p62 no es esencial para el desarrollo de vertebrados y 27 larvas de pez cebra por lo tanto puede desarrollarse normalmente antes de la infección. Sorprendentemente, las larvas de p62-agotado inoculados con S. resultado flexneri en un aumento significativo de la mortalidad y el aumento de la carga bacteriana 19. De acuerdo con el trabajo in vitro que muestran que el montaje septina jaula es interdependiente con la formación autofagosoma 7,8, reclutamiento septina a Shigella se reduce claramente en larvas p62-empobrecido ( <strong> Figura 4C). Estos datos demuestran que la supervivencia depende de pez cebra autofagia mediada por p62 para controlar la infección bacteriana intracelular. Figura 1. La jaula septinas in vitro. Células HeLa (A) se infectaron con S. flexneri durante 4 h 40 min, fijo, marcado con anticuerpos contra SEPT9 y phalloidin, y fotografiada por microscopía confocal. Barra de escala, 1 m. (B) células HeLa fueron infectadas con S. flexneri durante 4 h 40 min, fijo, marcado con anticuerpos frente a p62 y sept2, y fotografiada por microscopía de luz fluorescente. Barra de escala, 1 m. Células (C) HeLa fueron transfectadas con GFP-Atg8 / LC3, infectado con S. flexneri durante 4 h 40 min, fijo, marcado con anticuerpos contra sept2, y fotografiada por fluorescentes mi luzmicroscopia. Barra de escala, 1 m. Estas cifras se han modificado desde Mostowy et al 7. Figura 2. requisitos celulares para la formación jaula -septin Shigella. (A) células HeLa fueron tratados con control (CTRL), p62, ATG5, ATG6 o ATG7 siRNA. Lisados ​​de células enteras de células tratadas con siRNA se inmunotransfirieron para GAPDH, p62, ATG5, ATG6 o ATG7 para mostrar la eficiencia de agotamiento siRNA (arriba). siRNA células tratadas se infectaron con S. flexneri durante 4 h 40 min, fijo, y etiquetados para la microscopía cuantitativa. Gráficos (abajo) representan la media ± SEM% de Shigella dentro de jaulas de sept2 n ≥3 experimentos por tratamiento. (B) células HeLa fueron infectadas con S. flexneri, tratado con DMSO, citocalasina D (CytD), latrunculin B (LatB), nocodazole (Noco), o blebbistatin (ampolla) y después de 4 h 40 min se fijaron y etiquetados para la microscopía cuantitativa. Los gráficos representan la media ± SEM% de Shigella dentro de jaulas sept2 a partir de dos experimentos independientes por tratamiento. Estas cifras se han modificado desde Mostowy et al 7. Figura 3. El modelo de pez cebra de la infección por Shigella. (A) Imágenes para ilustrar la orientación de la larva de pez cebra bajo el microscopio estereoscópico. (Panel izquierdo) de pez cebra larvas de 72 h después de la fertilización se posiciona lateralmente en la placa de inyección con su lado dorsal hacia la aguja de inyección. Infección (panel medio) del torrente sanguíneo fue realizado por injecting las bacterias (solución roja) en la vena caudal, posterior a la apertura urogenital. (Panel derecho) La infección en el músculo de la cola se llevó a cabo mediante la inyección de las bacterias (solución de color rojo) sobre un somite. (B) Curvas de supervivencia de larvas de 72 horas después de la fertilización inyectados con diversas dosis de S. flexneri y se incubó a 28 ° C durante 48 h después de la infección. El inóculo efectivo se clasificó como bajo (<10 19.

Discussion

Al supervisar la autofagia y el citoesqueleto in vitro utilizando células de cultivo de tejidos, los protocolos descritos en las secciones 1 y 2 se pueden aplicar a una amplia variedad de tipos de células de cultivo de tejidos. Por otra parte, para seguir la autofagia (por ejemplo, Atg8 / LC3 + ve autofagosomas) y el citoesqueleto (por ejemplo., Colas de actina, jaulas septinas) dinámica, en tiempo real durante la infección por Shigella utilizando imágenes en vivo, las células de cultivo de tejido pueden ser transfectadas transitoriamente utilizando GFP, construcciones RFP- o CFP-etiquetado como anteriormente descritos 7,8. Para aumentar el porcentaje de células infectadas por Shigella (es decir, generalmente deseable para el análisis en tiempo real teniendo en cuenta que Shigella puede invadir 5-30% de las células HeLa en 100:. 1 MOI), añadir directamente 400 l de Shigella (OD 600 = 0,3 -0,6) a las células en 2 ml de MEM (suero de hambre) y esperar por lo menos 1,5 horas después de la infección para la entrada de bacterias suficiente, escapar del fagosoma, la replicación, aureconocimiento tophagy y enjaulamiento septina. Alternativamente, se puede utilizar la cepa de Shigella M90T AfaI que expresa la adhesina AfaE y han mucho más altas capacidades de invasión en las células epiteliales comparación con la cepa M90T 28. Es de destacar que la cepa M90T AfaI aún no se ha probado in vivo utilizando el pez cebra. Las placas de colonias de Shigella pueden mantenerse a 4 ° C durante 2-3 días y se utilizan para varios experimentos. Sin embargo, con el tiempo, las colonias de Shigella que han perdido el plásmido de virulencia también puede absorber el Rojo Congo y parece que han conservado su plásmido de virulencia. Por este motivo, se recomienda utilizar las cepas bacterianas frescos siempre que sea posible.

Cuando el control de la biología de las células de la infección in vivo, los protocolos descritos en las secciones 3 y 4 de tipo salvaje utilización AB línea de pez cebra. Para monitorizar las interacciones -leukocyte Shigella, líneas de pez cebra transgénico se pueden utilizar, por ejemplo, mpx: GFP o lyz: DsRed a Visualize neutrófilos 19,29,30 o MPEG1: mCherry visualizar macrófagos 19,31. Para visualizar la autofagia en vivo, la línea transgénica pez cebra-GFP Lc3 19,24 se puede utilizar como se describe en la sección 3.8.

Para perturbar la autofagia en vivo, la dosis efectiva oligonucleótido morfolino debe evaluarse experimentalmente en base a su eficacia para inhibir la transcripción de empalme o la traducción de proteínas. Es aconsejable llevar a cabo un experimento de valoración y para confirmar el agotamiento por RT-PCR (por oligonucleótido morfolino de empalme) o por SDS-PAGE (oligonucleótido de morfolino de traslación) 32. Aislamiento de ARN a partir de embriones de pez cebra o larvas se puede realizar mediante la extracción de tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo. Para extraer proteína a partir de larvas de pez cebra (8 a 15 larvas / tubo), homogeneizar mecánicamente usando una mano de mortero en 200 l de tampón de lisis (Tris 1 M, 5 M NaCl, 0,5 M EDTA, 0,01% octilfenol condensac óxido de etilenoe, y el inhibidor de la proteasa). Tubos centrífuga a 19.000 xga 4 ° C durante 15 min y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo. Añadir tampón de Laemmli y se calienta la muestra a 95 ° C durante 15 min. Lisados ​​pueden ser almacenadas a -80 ° C hasta que sea necesario, y pueden ser evaluadas por Western Blot como se describe en la sección 2.3.

El pez cebra es un modelo excelente para la aplicación del fármaco en vivo. Análisis utilizando oligonucleótidos de morfolino se puede complementar con fármacos establecidos para manipular la autofagia (por ejemplo, rapamicina y bafilomicina). Larvas no infectadas y / o infectados puede ser tratado con rapamicina (1,5 M) o bafilomicina (80 nM) diluido en E2 y el flujo de autofagia puede evaluarse mediante transferencia de Western como se describe en 25,33. La consecuencia de la manipulación de la autofagia en el resultado de la infección y la supervivencia de las larvas infectadas se puede evaluar como se describe en la sección 3.5.

Además de estudiar la célula huéspeddeterminantes, in vitro e in vivo protocolos pueden ser aplicados para evaluar determinantes bacterianas necesarias para el reconocimiento de la autofagia, utilizando cepas mutantes bacterianas que están diferencialmente reconocidos por la autofagia, por ejemplo., Shigella ΔicsA (la proteína Shigella ICSA recluta N-WASP y luego Arp2 / 3 de cola de actina y la formación septina jaula; en su ausencia no puede haber colas de actina, no hay jaulas septina) y ShigellaΔicsB (Shigella evita la respuesta autofagia mediante la proteína efectora bacteriana ICSB, lo que impide la contratación de maquinaria para la autofagia ICSA; en su ausencia no puede haber más jaulas septina, más autofagia) 7,8.

Shigella no es un patógeno natural de pez cebra y crece óptimamente a 37 ° C. Sin embargo, el trabajo ha demostrado que los factores de virulencia necesarios para la invasión Shigella, escapar de la vacuola fagocítica y la replicación en el CYTosol puede expresarse y son funcionales en larvas de pez cebra a 28 ° C 19. 28 ° C es la temperatura más comúnmente utilizado para la cría de pez cebra y la temperatura estándar para asegurar el desarrollo de pez cebra normal de 23. Sorprendentemente, los principales eventos patogénicos que conducen a la shigelosis en los seres humanos (es decir, la muerte celular de macrófagos, la invasión y multiplicación dentro de las células epiteliales, propagación de célula a célula, la destrucción inflamatoria del epitelio del huésped) se reproducen fielmente en el modelo de pez cebra de la infección por Shigella 19.

Genes autofagia y el citoesqueleto se expresan de forma ubicua y tienen una amplia gama de funciones biológicas. Estudios en ratones han demostrado que la eliminatoria de la autofagia esencial 26 o septina genes 5 son embriones letal, y es probable que algunos de estos genes también será esencial para el desarrollo del pez cebra (aunque este problema puede ser reducido por el hecho de que el pez cebra tiene múltiplesgenes paralogous 33). Si es así, hay varias alternativas para superar este problema, incluyendo (i) el uso de reactivos farmacológicos para regular la autofagia y el citoesqueleto, (ii) morfolinos se pueden valorar hacia abajo, (iii) knockout de los genes puede ser diseñado para sólo celda específica tipos, y / o (iv) los genes implicados en el reconocimiento autophagic que no son esenciales para el desarrollo animal (por ejemplo., p62) pueden ser el objetivo.

Mientras que el pez cebra es un sistema modelo ideal para investigar la autofagia y el citoesqueleto durante la infección por Shigella, herramientas moleculares actualidad se carece. El campo necesita para generar nuevas herramientas y expresión específica de células de accionamiento de las proteínas de interés. Para derribar expresión de genes autofagia / citoesqueleto, se requieren nuevas secuencias de morfolino, y nuevos métodos para la ingeniería del genoma (por ejemplo, TALEN, CRISPR / Cas9) también se pueden utilizar. Mientras tanto, varias herramientas generados anteriormente para los estudios de humanos o de ratónigualmente puede trabajar para el pez cebra.

Las bacterias intracelulares S. flexneri ha surgido como un organismo modelo excepcional para abordar las cuestiones clave en la biología, incluyendo la capacidad de las bacterias para ser reconocido por el sistema inmune 1,2. La célula hospedadora emplea septins para restringir la motilidad de S. flexneri y dirigirlos a la autofagia, un componente crítico de la inmunidad celular autónoma 7,8. Estas observaciones sugieren un nuevo marco molecular para estudiar la autofagia y su capacidad para degradar bacterias citosólicas. Una cuestión importante es ahora de descifrar completamente los eventos moleculares y celulares subyacentes, y para validar estos hechos analizados in vitro durante la infección bacteriana in vivo en modelos animales pertinentes. Para este fin, el pez cebra se ha establecido como un nuevo huésped valiosa para el análisis de S. infección flexneri 19. Las interacciones entre las bacterias y las células huésped se pueden obtener imágenes en alta resolución, yel modelo de pez cebra debería resultar útil para la comprensión de la biología celular de la infección por Shigella in vivo. Larvas de pez cebra se puede utilizar para investigar el papel de la autofagia bacteriana en la defensa del huésped, y el trabajo que ha demostrado que la perturbación de la autofagia puede afectar negativamente a la supervivencia de acogida en respuesta a la infección por Shigella 19.

Las observaciones generadas a partir de estudio de Shigella, septina enjaulamiento y autofagia in vitro utilizando células de cultivo de tejidos y en vivo utilizando larvas de pez cebra podría proporcionar avances fundamentales en la comprensión de la defensa del huésped. También podrían sugerir el desarrollo de nuevas estrategias para combatir las enfermedades infecciosas.

Un objetivo fundamental de este informe es dar sentido a los eventos moleculares y celulares analizados in vitro (es decir, la autofagia, las colas de actina, septina enjaular) durante la infección bacteriana in vivo en el contexto de una entIRE organismo, utilizando larvas de pez cebra. Si no está familiarizado con la biología del pez cebra y la manipulación, se puede hacer referencia a los protocolos de profundidad para la cría de pez cebra adecuada 23 y en el análisis in vivo de la infección por el pez cebra 19,35.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

El trabajo en el laboratorio de SM es apoyado por un Wellcome Trust Career Development Research Fellowship [WT097411MA].

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number
Bafilomycin A1 Sigma-Aldrich B1793 
Blebbistatin Sigma-Aldrich B0560
Borosilicate glass microcapillars  Harvard Apparatus 30038
Coarse manual manipulator  Narishige M-152
Cytochalasin D Sigma-Aldrich C6762
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Molecular Probes D1306
Dumont #5 fine tweezers Fine Science Tools 11254-20
Forchlorfeneuron  Sigma-Aldrich 32974
Goat anti-mouse IgG (H+L) antibody Molecular Probes N/A 
Goat ant-rabbit IgG (H+L) antibody Molecular Probes N/A
JetPEI transfection reagent Polyplus transfection 101-01N
Latrunculin B Sigma-Aldrich L5288
LC3 antibody Novus Biologicals NB100-2220
Low melting agarose Promega V2111
MatTek glass bottom dish MatTek corporation P35G-1.0-14
MEM plus L-alanyl-L-glutamine  GIBCO 41090028
MEM non-essential amino acids solution GIBCO 11140-035
Microinjector  Narishige IM-300
Micropipette puller device  Sutter Instrument Co., Novato, P-87 
Mineral oil Sigma-Aldrich P35G-1.0-14
Monoclonal anti-tubulin, acetylated antibody  Sigma-Aldrich T6793
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404
N-phenylthiourea  Sigma-Aldrich P7629
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Phalloidin  Molecular Probes A12379
Phenol red solution Sigma-Aldrich P0290
Protease inhibitor cocktail Roche 4693116001
p62/SQSTM1 antibody Cliniscience PM045
Rapamycin Sigma-Aldrich R8781
Sodium pyruvate GIBCO 11360039
Transfection reagent Life Technologies 12252-011
Vectashield hard set mounting medium containing DAPI  Vector Laboratories H-1500 
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Mazon Moya, M. J., Colucci-Guyon, E., Mostowy, S. Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions. J. Vis. Exp. (91), e51601, doi:10.3791/51601 (2014).
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