からのペプチドおよびタンパク質との組換えエラスチン様ポリペプチドおよびその融合の非クロマトグラフィー精製<em>エシェリヒア·コリ</em

1。ELP式 DMSOストックまたはEの寒天平板コロニーを滅菌したテリフィックブロス培地の3ミリリットルを接種T7-lacプロモーターの制御下で、所望のELPをコードするプラスミドを含有するタンパク質の発現に適した大腸菌 。適切な抗生物質を追加し、継続的に200rpmで振盪しながら37℃で一晩（O / N）でインキュベートする。 4リットルのフラスコ内のテリフィックブロスの滅菌培地を1リットルに、O / N培養の1ミリリットルを追加します。適切な抗生物質を追加し、200 rpmで連続振とうしながら24時間、37℃でインキュベートする。 NOTE：培養24時間インキュベートされた場合T7-lacプロモーターで見られる「漏出性」のベースライン発現は、多くのELPの高レベル発現に十分である。しかしながら、より従来のアプローチは、培養物の光学密度が0.6に達したときにタンパク質発現は、さらに0.2〜1 mMのイソプロピル-β-D-チオガラクトシド（IPTG）の添加によって誘導され、使用することができる。 </li> 2,000 X gで15分間、4℃で1Lの遠心分離ボトルや遠心分離機に4リットルのフラスコから文化を転送します。 上清を捨てる。 NOTE：培養物の1以上Lを成長させる場合、それらはペレットに培養物の他のリットルを添加し、工程1.3を繰り返すことにより凝縮させることができる。培養2 Lまでの単一細胞ペレットに凝縮することができる。 50mlコニカルチューブに細胞懸濁液と45mlの転写に到達するためにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、水、又は他の所望の緩衝液中にペレットを再懸濁。 2 ELP精製：。準備作業と逆転移サイクリングの最初のラウンド氷上でサンプルを維持しながら、10 '上'秒、85 Wの出力電力で20秒間「オフ」のサイクルで9分間、合計再懸濁した細胞ペレットを超音波処理する。簡単に説明すると、サンプルが氷の上で冷却してからもう一度9分サイクルを繰り返すことができます。注：ELPは、非常に低いT tを有することが予測される場合</サブ>「オフ」の間隔がT tを上記溶液の加熱を回避するために40秒まで増加させることができる。 50ミリリットルの丸底遠心管に溶解液を移す。 文化の各リットルのための10パーセントの2ミリリットル（w / v）のポリエチレンイミン（PEI）を追加し、混合する振る。注：PEIは負に荷電した遺伝的汚染物質の凝縮を助ける正に帯電したポリマーである。 PEIはまた、ELP製品を凝縮し、削除することができように、ELPが負に帯電している場合は、この手順を実行しないでください。 16,000 X gで10分間4℃で遠心します。 クリーン50ミリリットル丸底遠心管に上清を移し、ペレットを捨てる。 オプションのステップを「ベークアウト」：タンパク質汚染物質を変性させ、ELPが完全に可溶化されるまで4℃に、または氷に転送するために10分間60℃でサンプルをインキュベートする。遠心分離機16,000 X gで10分間4℃でのサンプル。 CLに上清を移し、50ミリリットルの丸底遠心管をEAN、ペレットを捨てる。注：ペプチドまたはタンパク質は、ELPと融合させて、上昇した熱の状態で変性することが期待されている場合は、この手順を実行しないでください。これは、ELP転移が熱不可逆的になるために、または融合された部分の活性を破壊することが原因となることがあります。 結晶性のNaCl（3Mを超えない）を加えることで、ELPの移行を誘導する。あるいは、クエン酸ナトリウム（0.3 Mを超えない）は、より高いT tをsまたは低い収率を有するELPは使用することができる。注： 塩が溶解した後、溶液は、溶液からのELPの相分離を示す、濁るべきである。高いT tをs の非常に親水性のELP ELPは、転移のこの予備誘導にELPの相分離を誘導するために、塩の添加と組み合わせて、ある程度の加熱を必要とし得る。 16,000 XG（ホットスピン）で10分間、室温temperatue（RT）で遠心分離する。注：ELPペレットをbすべきEそのサイズは、ELPの発現収量に依存し、観察した。このELPペレットは、最初に不透明に見えるかもしれませんが、冷却後には、半透明表示され、色が茶色である。浄化が進み、汚染物質が除去されるように、ELPペレットはより無色になります。 上清を捨て、ペレットに必要なバッファー1-5 mLを加え。ピペッティングによりペレットを再懸濁、または4℃で回転するようにチューブを設定する NOTE：緩衝液の体積は、必要ELPペレットのサイズ、および緩衝液の十分な量のELPペレットの可溶化を可能にするために添加されるべきであるELP発現の歩留まりに依存するであろう。混入タンパク質とジスルフィド相互作用を排除するpH7の10mMトリス（2 – カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（TCEP-HCl）を含む水中での精製からの高いシステイン含量の利益を有するのELP。その電荷を中和し、エレメントを低減するために調整されたpHで精製から高い電荷コンテンツ利益を有するのELP汚染タンパク質との相互作用ctrostatic。 新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに1mlアリコートに再懸濁したELPソリューションを転送します。 16,000 XG（コールドスピン）で10分間4℃で遠心します。不溶性汚染物質の小さなペレットが観察されるべきである。 きれいなチューブに上清を移し、ペレットを捨てる。 3 ELP精製：逆転移サイクリングのその後のラウンド熱および/またはNaClを添加したELP転移を誘導する。サンプルは、T tを超える温度で15分間ヒートブロックまたはウォーターバス中でインキュベートすることができる。場合は、しかしながら、ELPは（熱の使用を排除する）タンパク質に融合されるか、またはELPは熱のみで到達できない高いT tを有する場合には、NaClを5 M溶液を誘導するために滴下して添加することができるELP遷移。注：溶液は、溶液から、ELPの相分離を示す、曇りを有効にしてください。 <li> 16,000 XG（ホットスピン）で10分間遠心します。熱は、ステップ3.1で使用した場合、ELP転移を誘発するために必要であった温度よりも高い温度でこの遠心分離工程を行う。一人でのNaCl、ステップ3.1で使用された場合は、室温で、この遠心分離工程を行う。注：ELPペレットを観察する必要があります。 上清を捨て、必要なバッファーの500から750μLを加え、ピペッティングによりペレットを再懸濁または4℃で回転させるためにチューブをセット 16,000 XG（コールドスピン）で10分間4℃で遠心します。不溶性汚染物質の小さなペレットが観察されるべきである。 きれいなチューブに上清を移し、ペレットを捨てる。 全く汚染物質ペレットをステップ3.4の間に観察されなくなるまで繰り返して3.5に3.1を繰り返します。 4。後の精製処理（オプション） 必要に応じて、精製されたELP溶液から過剰の塩を除去するための適当な緩衝液に対してサンプルを透析。注：凍結乾燥されるべきのELPがあるべき4℃でのddH 2オブジェクト指向/ Nに対して透析所望であれば、前のO / Nを凍結乾燥すると30分間-80℃で溶液を凍結することによって、長期保存用のELPを凍結乾燥注：凍結乾燥が付加タンパク質とのELPには使用しないでください。 必要に応じて、ELPタグを削除することにより、ペプチドまたはタンパク質のELP融合から遊離ペプチドまたはタンパク質を回収。 ビオチン化プロテアーゼ（タンパク質分解酵素供給者によって推奨されているように）、または遺伝的にペプチドまたはタンパク質とELPの間で設計されたプロテアーゼ部位に対応するプロテアーゼのELP融合を有​​するペプチドまたはタンパク質のELP融合を消化。 該当する場合は、（プロテアーゼ供給業者により推奨されているように）、ストレプトアビジンで修飾されたビーズを用いてビオチン化プロテアーゼを削除します。 5 M NaCl溶液を滴下により開裂ELPおよび/またはプロテアーゼELP融合体の移行を誘導する。 16,000 X gで10分間、室温で遠心分離します。注：ELPペレットを観察する必要があります。 上清を回収し、ELPペレットを捨てる。所望のバッファーに対して上清を透析または純粋なペプチドまたはタンパク質溶液から高塩濃度を除去するために緩衝液交換を行うために遠心フィルターを使用。 ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によりELPタグから遊離ペプチドまたはタンパク質の完全な切断を確認する。 5キャラ：SDS-PAGE 2 – メルカプトエタノールを含むサンプル緩衝液10μlに水で希釈し、ELPの10μLを混合することにより、SDS-PAGE用のELPのサンプルを準備します。 NOTE：ELP40μgのELPは、しばしば、産物のサイズおよび純度を評価するのに十分である。 2分間100℃でサンプルをインキュベートした後、適切なサイズのタンパク質ラダーとともにポリアクリルアミドゲルにロードします。 色素がゲル（約45分）の底に近づくまで180 Vでゲルを実行します。 染色ロッキングしながら、5分間、0.5MのCuCl 2溶液を用いたゲル。注： いくつかのELP配列は、この色素と相互作用しないようにのELPは、一般的に、クマ​​シーブリリアントブルー染色により可視化されていません。クマシーブリリアントブルーは、アルギニン残基と主に相互作用し、他の塩基性残基ヒスチジンおよびリジンおよび芳香族残基、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン26と弱く相互作用します。従ってELPはペプチドまたはタンパク質ELP融合体は、それらの一次配列は、これらの特定の残基の十分な数が含まれている場合のみ、クーマシーブリリアントブルーで染色することができる。 ELPバンドのMwは、ELP遺伝子からと無関係な汚染物質のバンドが存在しないことを期待理論MWのものに対応することを確認します。注：一部のELPは、その予想されるMWの9、27よりも最大20％高い見かけの分子量で移動する。 6キャラ：マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析（MALDI-TOF-MS） 約25μmのELP濃度を達成するために0.1％トリフルオロ酢酸を含む50％アセトニトリル水溶液でELP溶液を調製する。注：このソリューションは、塩があってはならないので、ELPが精製後、H 2 Oに対して透析しなければなりません。 0.1％トリフルオロ酢酸を含む50％アセトニトリル水溶液に飽和シナピン酸マトリックス溶液を調製する。 約2.5ピコモル/μLのELP濃度を達成するためにマトリックス溶液9μlにELP溶液1μlを追加します。注：この混合物は、さらに、MALDI-TOF信号を最適化するために、マトリックス溶液で希釈することができる。 金属MALDIプレート上に堆積物ELP-マトリックス混合物の1〜2μlのスポットが完全に乾燥させます。 ELPの比（m / z）を充電し、その測定されたMWを推定するために質量を決定するためにMALDI-TOFで5-10スペクトルを得る。 7。CharacterizatioN：温度プログラム比濁法および動的光散乱温度プログラム濁によるELPのT tを決定します。 使用するバッファーでELPソリューション（5〜100μmでから、 例えば ）希釈系列を用意します。 温度制御されたUV-可視分光光度計を用いて、1℃/分の加熱速度で温度（ 例えば 、20〜80℃）の範囲にわたって350nmでの光学密度（OD）を測定する。 NOTE：ODの増加が見られない場合にはT tは 、器具の温度上限を超えることがある。見かけのT tは、NaClの添加によって減少させることができる。 1MのNaClから始まり、ELP遷移が測定可能な温度範囲内で検出されるまで、0.5 Mのステップで増加。 1°C /分の冷却速度で温度と同じ範囲にわたってODの減少を測定することにより、ELP転移の可逆性を確認する。 ホモのT tを決定する濁度プロファイル（ODは、温度に対してプロット）の変曲点を識別することによって、ポリマーELP。注：この温度は容易に誘 ​​導体の最大値に対応する温度をT tと定義されるOD曲線の導関数から定義することができる。より複雑なELP·アーキテクチャは、より複雑な濁度プロファイルが表示され、セクション7.2で説明したように、さらに分析する必要があります。 より複雑な熱的性質（球状ミセルに自己集合、例えば 、ELPジブロックコポリマー）を表示するのELPのさらなる特徴付けは、動的光散乱（DLS）によって達成される。 使用するバッファーでELP液を調製し、20から450 nmの細孔径を有するフィルターを通してサンプルを渡します。 NOTE：フィルターの孔径の選択は、溶液中の任意のELPアセンブリの有無、大きさ、および安定性に依存するであろう。最小の実現可能なフィルタ孔径は、次のような汚染物質を排除することが好ましいDLS測定の質を低下させるほこり、。小さいフィルタ細孔サイズを通してELPソリューションを渡すときに大きな抵抗を経験しているとき、より大きなフィルター孔サイズを使用する必要があります。 濁度プロファイルで識別された関心領域に対応する温度範囲にわたって流体力学的半径（R H）を測定する。注：ELPのユニマーは通常、R H <10 nmのナノ粒子集合体がR、H〜20〜100 nmであり、凝集体はR、Hがある> 500ナノメートルを持っています。 R Hの各増加は粒子の大きさに比例する温度の関数としてのUV-可視分光光度計により測定された350nmでのODの増加に対応すべきである。