تنقية الكروماتوغرافي من غير البروتينية المؤتلف الإيلاستين مثل والإنشطار مع الببتيدات والبروتينات من<em> كولاي</em
Summary
البروتينية مثل الإيلاستين هي البوليمرات الحيوية التحفيز تستجيب مع التطبيقات بدءا من تنقية البروتين المؤتلف لتسليم المخدرات. يصف هذا البروتوكول تنقية وتوصيف البروتينية مثل الإيلاستين والببتيد أو البروتين اندماج بهم من القولونية باستخدام درجة حرارة المحلول المرحلة الانتقالية السلوك أقل الحرجة كبديل بسيطة لاللوني.
Abstract
البروتينية مثل الإيلاستين هي البوليمرات الحيوية المتكررة التي تظهر في مرحلة الحل درجة الحرارة أقل السلوك الحرجة التي تمر بمرحلة انتقالية، كما unimers للذوبان الموجودة تحت درجة حرارة التحول مميزة وتجميع في coacervates ميكرون النطاق فوق درجة حرارة انتقالها. تصميم البروتينية مثل الإيلاستين على المستوى الجيني يسمح بالتحكم الدقيق في تسلسلها وطول، والتي تملي خصائصها الحرارية. وتستخدم البروتينية مثل الإيلاستين في مجموعة متنوعة من التطبيقات بما في ذلك biosensing، هندسة الأنسجة، وتسليم المخدرات، حيث درجة حرارة التحول والهندسة المعمارية من البوليمر الحيوي ELP يمكن ضبطها لتطبيق معين من الفائدة. وعلاوة على ذلك، فإن المرحلة الانتقالية درجة حرارة المحلول السلوك أقل تنتقد البروتينية مثل الإيلاستين يسمح تنقية من خلال استجابتها الحرارية، بحيث تقوصر بهم انتقائية وresolubilization يسمح إزالة كل الملوثات القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبانق التالية التعبير في الإشريكية القولونية. ويمكن استخدام هذا النهج لتنقية البروتينية مثل الإيلاستين وحدها أو بوصفها أداة لتنقية الببتيد أو البروتين اندماج حيث الببتيدات أو البروتينات المؤتلف وراثيا لإلحاق به ببتيد مثل الإيلاستين يمكن تنقيته دون اللوني. يصف هذا البروتوكول تنقية البروتينية مثل الإيلاستين والببتيد أو البروتين اندماج ويناقش تقنيات توصيف الأساسية لتقييم السلوك الحراري للمنتجات نقية ببتيد مثل الإيلاستين.
Introduction
الإيلاستين البروتينية مثل (ELPs) هي البوليمرات الحيوية تتألف من VPGXG خماسي الببتيد مكرر حيث X، بقايا الضيف، أي الأحماض الأمينية إلا البرولين. ELPs المعرض درجة حرارة المحلول أقل الحرجة (LCST) مرحلة انتقالية السلوك، مثل أن الحل ELP متجانسة سيفصل إلى مرحلتين عند التسخين لLCST لها، وهو ما يسمى عادة درجة حرارة التحول العكسي (T ر) في الأدب ELP 1. وتتكون المرحلتين من ELP المرحلة كرية مخفف جدا ومرحلة الرواسب الغنية ELP. يتم تشكيل الرواسب الغنية ELP على فترة زمنية قصيرة على تجميع سلاسل ELP الى جزيئات ميكرون الحجم التي تتجمع في وقت لاحق. يحدث هذا السلوك على مجموعة من بضع درجات مئوية وعادة ما هو عكسها، كما يتم استرداد حل متجانسة عند عودته إلى درجة حرارة أقل من T ر.
وعادة ما يتم تصنيعه في ELPs كولاي (كولاي) جيئة وذهابام الجينات الاصطناعية التي هو ligated إلى البلازميد التعبير. ثم يتم تحويل هذا البلازميد إلى E. خط الخلية القولونية التي هي الأمثل للتعبير البروتين. وقد استخدمنا حصرا النظام متجه T7 لاك حيوان أليف للتعبير عن مجموعة كبيرة ومتنوعة من ELPs في E. القولونية، على الرغم من أن أنظمة التعبير الأخرى في الخميرة 2-4، الفطريات 5، والنباتات 6-8 كما تم استخدامها من قبل المحققين الأخرى. ويوجد عدد من النهج لبناء وراثيا الجينات ELP المتكررة، بما في ذلك ربط العودية الاتجاه (RDL) 9، ربط الاتجاه العودية بواسطة إعادة الإعمار البلازميد (PRE-RDL) 10، وتتداخل تمديد المتداول دائرة التضخيم (OERCA) 11. القدرة على مهندس ELPs على المستوى الجيني يتيح الفرصة لاستخدام تقنيات الحمض النووي المؤتلف لخلق ELPs مع مجموعة متنوعة من أبنية (على سبيل المثال، وحيدة، diblocks، triblocks، الخ)، والتي يمكن زيادة إلحاق مع ظيفيةالببتيدات والبروتينات. السيطرة على المستوى الجيني يضمن أيضا أن يتم التعبير عن كل ELP مع طول الدقيق وتكوين تمليها قالب البلازميد الوراثية، وتوفير منتجات البوليمر الحيوي monodisperse تماما.
الخصائص الحرارية من كل ELP تعتمد على المعلمات الجوهرية إلى البوليمر الحيوي مثل الوزن الجزيئي (MW)، وتسلسل، وكذلك العوامل الخارجية بما في ذلك تركيزه في حل وجود cosolutes الأخرى، مثل أملاح. طول ELP 12 و تكوين بقايا ضيفه 1، 13، 14 هي معلمتين متعامد في تصميم ELP التي يمكن استخدامها للسيطرة على ر T، حيث تؤدي مخلفات ضيف مسعور وأطوال سلسلة يعد في أقل تي تي، في حين ماء بقايا الضيوف وأطوال سلسلة أقصر يؤدي إلى ارتفاع T ر ق. تركيز ELP يرتبط عكسيا مع ر T، حيث من الحلول غرامتركيز آكلى لحوم البشر ELP يكون أقل T ر ق 12. نوع وتركيز الأملاح تؤثر أيضا على ELP تي تي، حيث تأثير الأملاح يتبع سلسلة هوفمايستر 15. الأنيونات Kosmotropic (الكلورين – وأعلى في سلسلة هوفمايستر) خفض ELP T ر وزيادة تركيز الملح يعزز هذا التأثير. يمكن ضبطها هذه المعايير الجوهرية وخارجي للحصول على السلوك الحراري في درجة حرارة تتراوح الهدف ما هو مطلوب لتطبيق معين من ELP.
سلوك التحفيز استجابة من ELPs مفيد لمجموعة متنوعة من التطبيقات بما في ذلك biosensing 16، 17، 18 هندسة الأنسجة، وتسليم المخدرات 19 و 20. بالإضافة إلى ذلك، عندما تنصهر ELPs لالببتيدات أو البروتينات على المستوى الجيني، يمكن للELP بمثابة علامة تنقية بسيطة لتوفير وسيلة غير مكلفة لتنقية دفعة من الحماسي المؤتلفالمد والجزر أو البروتينات التي لا تتطلب اللوني 21. التعديل من عملية تنقية يضمن أن نشاط بروتين الببتيد أو تنصهر إلى ELP المحافظة. الببتيد أو البروتين ELP اندماج يمكن تنقية للتطبيقات التي العلامة ELP مفيد 22، 23 أو بدلا من ذلك، عندما يكون مطلوبا الببتيد مجانا أو البروتين، يمكن إدراج موقع الاعتراف البروتيني بين الببتيد أو البروتين وELP. ومن ثم يمكن تحقيق إزالة العلامة ELP بواسطة الهضم مع البروتيني حرة أو ELP الانصهار البروتيني، حيث يوفر هذا الأخير سهولة إضافية من تجهيز وجولة نهائية من تنقية ELP يمكن فصل ELP العلامة والبروتيني ELP الانصهار من الببتيد الهدف أو البروتين في خطوة واحدة 24 و 25. يصف بروتوكول باتباع الإجراء لتنقية ELPs والببتيد أو البروتين ELP اندماج عن طريق خصائصها الحرارية ويناقش التقنيات الأساسية للتميزالاستجابة الحرارية من المنتجات ELP.
Protocol
Representative Results
Discussion
ELPs تقدم وسيلة غير مكلفة وخالية من اللوني تنقية عن طريق استغلال سلوكهم مرحلة التحفيز استجابة. هذا النهج يستفيد من السلوك LCST من ELPs والببتيد أو البروتين ELP اندماج للقضاء على كل من الملوثات القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان بعد التعبير عن ELPs المشفرة وراثيا في E. القولونية. هذا سهولة تنقية يمكن استخدامها لإنتاج ELPs لمجموعة متنوعة من التطبيقات، أو يمكن استغلالها لتنقية الببتيدات أو البروتينات المؤتلف الذي ELP يمكن أن تكون بمثابة علامة تنقية التي يمكن إزالتها مع تجهيز تنقية آخر.
ينطوي تنقية ELP الخطوات الأولية لليز E. القولونية وإزالة الجيني وغير قابلة للذوبان حطام خلية من الثقافة المحللة الخام (الشكل 1)، يليه إزالة الملوثات القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان المتبقية عن طريق مركز التجارة الدولية (الشكل 2). الطرد المركزي بعد إحداث التحول ELP من قبل عدينشوئها من الحرارة أو الملح يفصل ELP من الملوثات القابلة للذوبان في طاف، في خطوة توصف تدور الساخنة. بعد resolubilizing في ELP، يتم طرد الحل مرة أخرى عند درجة حرارة أقل من T ر لإزالة الملوثات بيليه غير قابلة للذوبان، في خطوة توصف تدور الباردة. يدور بالتناوب الساخنة والباردة يحسن نقاء الحل ELP مع كل دورة، بتكلفة صغيرة لانتاج. غلة تنقية تختلف تبعا لELP تي تي، وطول، والببتيدات تنصهر أو البروتينات. عادة، هذا البروتوكول ينتج 100 ملغ من ELP تنقيته للتر الواحد من E. ثقافة القولونية، ولكن غلة يمكن أن تصل إلى 500 ملغ / لتر. يتم تأكيد نقاء النهائي للمنتج ELP بواسطة SDS-PAGE (الشكل 3). ميغاواط من ELP النقي يجب أن تطابق بشكل وثيق مع ميغاواط النظرية المشفرة بواسطة الجينات ELP. ومع ذلك، فإن بعض ELPs الهجرة في SDS-PAGE مع MW الظاهر أعلى تصل إلى 20٪ من MW المتوقعة على 9، 27. تحليل أكثر دقة للELPلا يمكن أن يتحقق ميجاوات بحلول MALDI-TOF-MS، والتي يمكن أيضا تقديم معلومات إضافية عن نقاء المنتج ELP جنبا إلى جنب مع التقنيات التحليلية متعامد مثل اللوني السائل عالي الأداء (HPLC).
تنقية التالية، يتم قياس ELP تي تي من قبل يحددها درجة الحرارة قياس العكر. هذه التقنية تراقب OD من حل ELP في حين يتم زيادة درجة الحرارة. تي تي هو تركيز تعتمد ولذلك فمن المستحسن أن تميز سلسلة تركيز ذات الصلة بتطبيق المقصود من ELP. لhomopolymers ELP الشخصى التعكر يسلك زيادة حادة واحد الذي يتوافق مع انتقال ELP من unimer المجاميع إلى ميكرون النطاق (الشكل 4A). يتم تعريف T T ودرجة الحرارة المقابلة لنقطة انعطاف في ملف تعريف التعكر، تحدد بالضبط كما الحد الأقصى للمشتقة الأولى من التطوير التنظيمي فيما يتعلق درجة الحرارة. حالة العكس منوأكد ELP المرحلة الانتقالية انخفاض في OD إلى خط الأساس كما هو خفض درجة حرارة أقل من تي تي (الشكل 4B). سوف الشخصى التعكر مع زيادة وخفض درجة الحرارة سلالم تختلف في حجمها وحركية بسبب تسوية من coacervates ELP والتباطؤ متغير ELP resolubilization. الببتيد أو البروتين ELP اندماج يحمل بالمثل السلوك LCST في هذا الطريق، حيث الببتيد أو البروتين تنصهر إلى ELP يؤثر على T ر. للبروتين اندماج ELP التحول هو عكسها تحت درجة حرارة انصهار من البروتين. بينما يحددها درجة الحرارة قياس العكر هو وسيلة ممتازة لتوصيف الحرارية من المنتجات الأولية ELP، وتقنيات بديلة، مثل المسح التفاضلي قياس الكالوري (DSC)، ويمكن أيضا أن تستخدم لقياس ELP T ر.
ELPs مع السلوكيات الحرارية أبنية المعرض أكثر تعقيدا أكثر تعقيدا التي يمكن أيضا أن تتميز درجة الحرارة PROGRAقياس العكر mmed. ELP diblock بوليمرات، على سبيل المثال، تظهر لمحة التعكر مميزة الموافق أثار درجة حرارتها التجميع الذاتي في المذيلات كروية في درجة حرارة micellization الحرجة. لمثل هذه diblock بوليمرات ELP لOD عادة أول يزيد 0.1-0.5 وحدة فوق خط الأساس تشير إلى الانتقال من unimers لالمذيلات، وبعد ذلك زيادة حادة في التطوير التنظيمي (تصل إلى 2.0 وحدة فوق خط الأساس) عند درجة حرارة أعلى يدل على تشكيل ميكرون النطاق المجاميع (الشكل 5A). يتم الحصول على معلومات إضافية حول الذاتي تجميعها الهياكل ELP-تسبب درجة الحرارة مع دائرة الأراضي والمساحة، وهي تقنية الذي يقيس R H المجالس ELP في الحل. التغييرات في R H توافق بشكل وثيق مع التغيرات في قياس OD مع قياس العكر (الشكل 5B). unimers ELP عادة يحمل R H <10 نانومتر بينما الجمعيات جسيمات متناهية الصغر يحمل R H ~ 20-100 نانومتر والمجاميع يحمل R H </suب >> 500 نانومتر. معلومات إضافية حول الذاتي تجميعها النانوية ELP، مثل تجميع عدد والتشكل، ويمكن الحصول على تشتت الضوء ثابتة أو المبردة المجهر الإلكتروني النافذ 17، 23، 29.
نظرا لو tunability من الخواص الحرارية ELP، يتم الحصول على مجموعة من T ر ق من خلال التصاميم ELP المختلفة. من المهم أن نأخذ في الاعتبار أن المتأصلة T ر ستؤثر على تعظيم الاستفادة من بروتوكول تنقية لكل ELP، حيث منخفضة للغاية أو عالية T ر ق سيتطلب معظم التعديل في هذا البروتوكول القياسي. ELPs مع درجات حرارة مرتفعة للغاية تمر بمرحلة انتقالية قد تكون غير مناسبة لتنقية مع هذا النهج. إذا كان التصميم من ELPs الرواية والببتيد أو البروتين ELP اندماج قد تعرض للخطر الاستجابة الحرارية للELP، يمكن إدراج علامة بسيطة لتنقية الحامض الاميني البديلة يجمد اللوني تقارب المعادن. بالإضافة إلى ذلك،خصائص تسلسل ELP قد تتطلب تعديل هذا البروتوكول إذا اتهم بقايا ضيف. التلاعب في درجة الحموضة عازلة يمكن استخدامها كوسيلة لتغيير تهمة العام للELP في محاولة للقضاء على التفاعلات مع الملوثات كهرباء 17. وعلاوة على ذلك، وهذا البروتوكول هو مناسبة لظرف خاص من اندماج ELP مع الببتيدات والبروتينات عند اتخاذ التدابير المناسبة لضمان عملية تنقية لا التشويش على نشاط شاردة تنصهر. مذكرات في جميع أنحاء بروتوكول بشأن هذه التعديلات تعمل على توجيه تنقية ELPs التي قد تقدم هذه التحديات فيما يتعلق تي تي، تهمة، أو مخاوف الانصهار.
تنقية ELPs عن طريق السلوك LCST بهم يقدم مقاربة بسيطة وخالية من اللوني لتنقية غالبية ELPs والببتيد أو البروتين ELP اندماج المعبر عنها في E. القولونية. بروتوكول تلخيصها هنا يسمح تنقية سو ELPs في يوم واحد باستخدام المعدات التي هي مشتركة بين معظم مختبرات البيولوجيا. سهولة تنقية ELPs واندماج إرادتهم، ونحن نأمل، تشجيع التنوع المتزايد من التصاميم ELP التطبيقات الجديدة في علوم المواد، والتكنولوجيا الحيوية، والطب.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل جبهة الخلاص الوطني للبحوث المثلث MRSEC (DMR-1121107).
Materials
| pET-24a(+) pET-25b(+) |
Novagen | 69749-3 69753-3 |
T7-lac expression vectors with resistance to kanamycin (pET-24) or ampicillin (pET-25). |
| Ultra BL21 (DE3) competent cells | Edge BioSystems | 45363 | Competent E. coli for recombinant protein expression. |
| Terrific Broth (TB) Dry Powder Growth Media | MO BIO Laboratories | 12105 | Media is reconstituted in DI H2O and autoclaved before use. |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG) | Gold Biotechnology | I2481C | IPTG is reconstituted in DI H2O, sterile filtered, and added to cultures to induce enhanced expression. |
| Phosphate buffered saline (PBS) tablet | Calbiochem | 524650 | These PBS tablets, when dissolved in 1 L of DI H2O, yield a 10 mM phosphate buffer with 140 mM NaCl, and 3 mM KCl with a pH of 7.4 at 25 °C. |
| Polyethyleneimine (PEI) Solution (~50% w/v) | MP Biomedicals | 195444 | PEI is prepared as a 10% (w/v) solution in deionized H2O. |
| Nalgene Oak Ridge high-speed centrifuge tubes, 50 mL | Thermo Scientific | 3138-0050 | These round-bottom tubes withstand high-speed centrifugation of 30-50 ml. |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP-HCl) | Thermo Scientific | 20491 | A stock solution of TCEP-HCl is prepared at 100 mM in DI H2O and adjusted to pH 7.0. For ELPs with a high cysteine content the stock solution of this reducing agent is added to the ELP pellet to reach 10 mM in H2O. |
| Ready Gel Tris-HCL gel, 4-20% linear gradient polyacrylamide gel, 10 well, 30 μl | Bio-Rad Laboratories | 161-1105 | These linear gradient gels offer good visualization of ELPs with a range of MWs. |
| Cupric chloride dihydrate (CuCl2-2H2O) | Fisher Scientific | C454-500 | A filtered 0.5 M solution is prepared for negative staining of Tris-HCL polyacrylamide gels. |
| Anotop 10 syringe filter: 0.02 μm 0.1 μm 0.2 μm |
Whatman | 6809-1002 6809-1012 6809-1022 |
These 10 mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes for DLS measurements. |
| Millex-HV filter: 0.45 μm |
EMD Millipore | SLHVX13NK | These 13 mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes of solutions with large nanoparticle assemblies for DLS measurements. |
References
- Urry, D. W. Physical Chemistry of Biological Free Energy Transduction As Demonstrated by Elastic Protein-Based Polymers. J. Phys. Chem. B. 101, 11007-11028 (1997).
- Sallach, R. E., Conticello, V. P., Chaikof, E. L. Expression of a recombinant elastin-like protein in pichia pastoris. Biotechnology progress. 25, 1810-1818 (2009).
- Schipperus, R., Teeuwen, R. L., Werten, M. W., Eggink, G., de Wolf, F. A. Secreted production of an elastin-like polypeptide by Pichia pastoris. Appl Microbiol Biotechnol. 85, 293-301 (2009).
- Schipperus, R., Eggink, G., de Wolf, F. A. Secretion of elastin-like polypeptides with different transition temperatures by Pichia pastoris. Biotechnology progress. 28, 242-247 (2012).
- Herzog, R. W., Singh, N. K., Urry, D. W., Daniell, H. Expression of a synthetic protein-based polymer (elastomer) gene in Aspergillus nidulans. Appl Microbiol Biotechnol. 47, 368-372 (1997).
- Conley, A. J., Joensuu, J. J., Jevnikar, A. M., Menassa, R., Brandle, J. E. Optimization of elastin-like polypeptide fusions for expression and purification of recombinant proteins in plants. Biotechnology and bioengineering. 103, 562-573 (2009).
- Conrad, U., et al. ELPylated anti-human TNF therapeutic single-domain antibodies for prevention of lethal septic shock. Plant biotechnology journal. 9, 22-31 (2011).
- Kaldis, A., et al. High-level production of human interleukin-10 fusions in tobacco cell suspension cultures. Plant biotechnology journal. 11, 535-545 (2013).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3, 357-367 (2002).
- McDaniel, J. R., Mackay, J. A., Quiroz, F. G., Chilkoti, A. Recursive directional ligation by plasmid reconstruction allows rapid and seamless cloning of oligomeric genes. Biomacromolecules. 11, 944-952 (2010).
- Amiram, M., Quiroz, F. G., Callahan, D. J., Chilkoti, A. A highly parallel method for synthesizing DNA repeats enables the discovery of ‘smart’ protein polymers. Nat Mater. 10, 141-148 (2011).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Quantification of the effects of chain length and concentration on the thermal behavior of elastin-like polypeptides. Biomacromolecules. 5, 846-851 (2004).
- Urry, D. W., et al. Temperature of Polypeptide Inverse Temperature Transition Depends on Mean Residue Hydrophobicity. Journal of the American Chemical Society. 113, 4346-4348 (1991).
- Urry, D. W. The change in Gibbs free energy for hydrophobic association – Derivation and evaluation by means of inverse temperature transitions. Chem Phys Lett. 399, 177-183 (2004).
- Cho, Y., et al. Effects of Hofmeister anions on the phase transition temperature of elastin-like polypeptides. The journal of physical chemistry. B. 112, 13765-13771 (2008).
- Kim, B., Chilkoti, A. Allosteric actuation of inverse phase transition of a stimulus-responsive fusion polypeptide by ligand binding. J Am Chem Soc. 130, 17867-17873 (2008).
- Hassouneh, W., Nunalee, M. L., Shelton, M. C., Chilkoti, A. Calcium binding peptide motifs from calmodulin confer divalent ion selectivity to elastin-like polypeptides. Biomacromolecules. 14, 2347-2353 (2013).
- Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 62, 1479-1485 (2010).
- MacEwan, S. R., Chilkoti, A. Elastin-like polypeptides: biomedical applications of tunable biopolymers. Biopolymers. 94, 60-77 (2010).
- McDaniel, J. R., Callahan, D. J., Chilkoti, A. Drug delivery to solid tumors by elastin-like polypeptides. Adv Drug Deliv Rev. 62, 1456-1467 (2010).
- Hassouneh, W., Christensen, T., Chilkoti, A. Elastin-like polypeptides as a purification tag for recombinant proteins. Curr Protoc Protein Sci. , (2010).
- Shamji, M. F., et al. Development and characterization of a fusion protein between thermally responsive elastin-like polypeptide and interleukin-1 receptor antagonist: sustained release of a local antiinflammatory therapeutic. Arthritis Rheum. 56, 3650-3661 (2007).
- Hassouneh, W., et al. Unexpected multivalent display of proteins by temperature triggered self-assembly of elastin-like polypeptide block copolymers. Biomacromolecules. 13, 1598-1605 (2012).
- Lan, D. M., et al. An improved nonchromatographic method for the purification of recombinant proteins using elastin-like polypeptide-tagged proteases. Analytical Biochemistry. 415, 200-202 (2011).
- Bellucci, J. J., Amiram, M., Bhattacharyya, J., McCafferty, D., Chilkoti, A. Three-in-one chromatography-free purification, tag removal, and site-specific modification of recombinant fusion proteins using sortase A and elastin-like polypeptides. Angewandte Chemie. 52, 3703-3708 (2013).
- Compton, S. J., Jones, C. G. Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay. Anal Biochem. 151, 369-374 (1985).
- McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP. Protein expression and purification. 7, 51-57 (1996).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nat Biotechnol. 17, 1112-1115 (1999).
- McDaniel, J. R., et al. Self-assembly of thermally responsive nanoparticles of a genetically encoded peptide polymer by drug conjugation. Angewandte Chemie. 52, 1683-1687 (2013).
